酚菌酮銅絡合物的合成及其對蘋果斑點落葉病菌的生物活性研究

凌崗 程小兵 袁樹忠

摘 要：該研究以酚菌酮、氯化銅和氨水為主要原料，合成了酚菌酮銅絡合物，收率97.6%；采用生長速率法（平皿法）研究酚菌酮銅絡合物對蘋果斑點落葉病菌生長抑制作用。結果表明，酚菌酮銅絡合物對蘋果斑點落葉病菌有較高的毒力，使用濃度以400～500mg/L為宜。

關鍵詞：酚菌酮；銅；蘋果；斑點落葉病菌

中圖分類號 S436.611 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）10-0070-02

蘋果斑點落葉病又稱褐紋病，主要危害葉片，造成早落，也危害新梢和果實，影響樹勢和產量，而且侵害果實，降低果品質量，在各蘋果產區都有發生，成為蘋果生產上的重大病害之一。酚菌酮是騰龍公司的專利產品，其用于水稻稻瘟病[1]、紋枯病[2]以及小麥白粉病[3]的防治已有文獻發表，但沒有用于防治其他病害的報道。銅化合物是重要的農用殺菌劑，無機銅制劑在果樹和作物的花期及幼果期使用易產生藥害，有機銅制劑殺菌譜廣、低殘留、污染小、安全可靠，并與環境相容性好、親和性好，可以與其他作用的農藥相混用。目前有機銅制劑主要有：噻菌銅（龍克菌）（20%SC）、喹啉銅、松脂酸銅、壬菌銅、腐殖酸銅等[4]。本研究首次合成了酚菌酮銅絡合物，合成路線如圖1所示。采用生長速率法對抑制蘋果斑點落葉病菌生長進行了試驗，旨在為該化合物進一步應用開發提供可靠的依據。

圖1 酚菌酮銅絡合物合成路線

1 合成實驗部分

1.1 儀器與試劑 儀器：Bruker AC-400型核磁共振儀（以CDCl3為溶劑，TMS為內標）；x一4數字顯示顯微熔點測定儀，溫度未校正；液相色譜Agilent 1100。試劑：酚菌酮（江蘇騰龍生物藥業有限公司技術中心提供），其余試劑市售，氨水（25%～28%）。

1.2 合成工藝 向裝有排空冷凝器、溫度計、攪拌棒的500mL四口燒瓶中加入氯化銅21.3g（0.125mol）和去離子水250mL，攪拌滴加氨水40g（25%～28%）（0.588mol）控制溫度在40℃左右，滴完保溫攪拌1h。滴加43.6g95%酚菌酮原油控制溫度在50℃以下，同時滴加32%液堿31.3g（0.28mol），滴完保溫3h，降溫過濾，水洗、烘干得產品47.4g，經液相檢測，歸一純度為95%，收率為97.6%（mp：133～135℃）。1H NMR（CDCl3，400MHz）δ：6.71～7.82（m，CH2，苯環），6.383（t，2H，CH2），2.042（m，5H，CH2），1.038（t，2H，CH3）。

2 活性測定部分

2.1 試驗靶標 供試病原真菌為蘋果斑點落葉病菌（Alternaria alternate f.sp.mali），菌株由南京農業大學殺菌劑實驗室提供。

2.2 儀器與試劑 電子天平（感量0.0001g），生物培養箱，蒸汽滅菌鍋，干熱滅菌烘箱，超凈工作臺，直徑90mm培養皿，移液器，接種針，打孔器（內徑6mm），卡尺。N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（國藥集團），吐溫-80（國藥集團）。

2.3 培養條件 生物培養箱內（25±1）℃。

2.4 毒力測定方法 參照NY/T1156.2-2006標準推薦的平皿法，步驟如下：（1）病菌準備：室內培養蘋果斑點落葉病菌，備用。（2）酚菌酮銅絡合物測試濃度藥液的配制：先用精密電子天平精確稱取酚菌酮銅絡合物原藥0.2000g 于10mL容量瓶中，用DMF溶解并定容，得20000mg/L的酚菌酮銅絡合物溶液，將此溶液用滅菌的0.1%吐溫-80水溶液稀釋，根據預備試驗結果，藥劑測定濃度設為15.63、31.25、62.5、125、250、500mg a.i./L，以添加等量0.1%吐溫-80水溶液為對照。所有處理重復4次。（3）藥劑處理：在無菌條件下，將配制的各處理藥液，分別加到預先融化開的PSA培養基中，充分搖勻后，平均傾入4個培養皿中，冷卻后制成含藥培養基平板，并且以不加藥為對照處理。（4）接種與培養：將預先培養好的蘋果斑點落葉病菌，在無菌條件下，用直徑6mm的打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊。在無菌操作條件下，將菌絲塊移入含藥培養基平板中央，每皿放1個，菌絲面朝下，蓋上皿蓋，然后將培養皿倒置放入25℃生物培養箱中培養3d。（5）結果調查：培養結束后，用卡尺測量各處理培養皿中病菌菌落直徑（mm），十字形交叉各測量一次，取平均值即為菌落直徑（D）。（6）數據處理方法：用Excel計算菌菌生長直徑和生長抑制率，公式如下：

生長直徑D1=菌落直徑D-菌絲塊直徑D0；

生長抑制率（%）=[對照的生長直徑-處理的生長直徑對照的生長直徑×100]

用DPS6.55軟件對藥劑的處理濃度與生長抑制率進行回歸分析，計算毒力回歸方程，求取抑制中濃度（IC50）、抑制生長90%濃度（IC90）及其95%置信限。

2.5 試驗結果 測定結果表明，酚菌酮銅絡合物的濃度在15.63～500mg/L時，對蘋果斑點落葉病菌的生長抑制率達到6.43%～98.57%，用毒力回歸方程的方法對藥劑濃度與抑制率進行轉換、線性回歸，得到回歸方程如表1所示。從回歸方程中，計算得到，酚菌酮銅絡合物對蘋果斑點落葉病菌菌絲生長的抑制中濃度（IC50）為90.5615mg/L，IC90為316.7680mg/L。

3 結論與討論

試驗結果表明，酚菌酮銅絡合物對蘋果斑點落葉病菌有較高的毒力，IC50為90.5615mg/L，與段俊飛等報道的藥劑活性相比，酚菌酮銅絡合物對蘋果斑點落葉病菌的活性高于75%百菌清WP（IC50=122.8875mg/L[5]，下同）、65%代森鋅WP（124.1855mg/L[5]），明顯高于50%醚菌酯WG（743.0596mg/L[5]）和80%多菌靈WP（1665.8480mg/L[5]）。根據本試驗結果，酚菌酮銅絡合物對蘋果斑點落葉病菌菌絲生長抑制率為90%的濃度理論值316.7680mg/L，實際試驗中500mg/L的抑制率達到98%以上，因此，在防治蘋果斑點落葉病時，建議酚菌酮銅絡合物的濃度為400～500mg/L。

參考文獻

[1]陳高祥，王太高.40%酚菌酮EW等防治水稻稻瘟病田間藥效試驗[J].大麥與谷類科學，2010，01：50.

[2]梅桂芳，章玉琴，孟愛中，等.40%酚菌酮水乳劑防治水稻紋枯病田間藥效試驗初報[J].安徽農學通報，2012，18（04）：69-70.

[3]季文祥，王玉國，皋古西，等.40%酚菌酮水乳劑防治小麥白粉病田間藥效試驗報告[J].農業開發與裝備，2013，06：55，103.

[4]劉艷，王振軍.有機銅類化合物殺菌劑的發展現狀與展望[J].農業科學通訊，2015，01：177-179.

[5]段俊飛，趙緒生，胡同樂，等.幾種殺菌劑對蘋果斑點落葉病菌的室內毒力及田間防效[J].中國植保導刊，2012，23（8）：53-57.

（責編：張宏民）