液相芯片技術在動物病原微生物檢測中的應用

（浙江省動物疫病預防控制中心，浙江杭州 311199）

液相芯片技術（Multi-analyte profiling，solve for unknown x，xMAP technology），是20世紀90年代中期美國 Luminex公司開發出的被喻為后基因組時代的芯片技術。它以微球體代替細胞作為反應載體，可進行蛋白、核酸等生物大分子的檢測，不僅從細胞水平深入到分子水平，其檢測范圍也得到前所未有的擴展?，F就液相芯片的技術原理、特點及其在動物病原微生物檢測方面的應用做一綜述。

1 基本原理

1995年，美國Luminex公司將流式細胞儀、數字信號處理器和一種激光檢測裝置相結合，開發了一種具有多指標同步分析（xMAP）功能的芯片技術，也稱為液態芯片（Liquid chip）或懸浮芯片（Suspension array）?；驹硎牵?/p>

xMAP技術以流式細胞儀為檢測平臺，用許多大小均一穩定的微球為載體，微球內部含有三種熒光免疫熒光，通過熒光不同的比例可以區分500種不同的微球，每種微球可以用來檢測一種不同的蛋白或基因。該技術利用熒光編碼的微球共價交聯單克隆抗體，與被測定的目標分子結合后，加入熒光素標記的檢測抗體，再通過激光掃描熒光編碼來識別單個微球和測量“檢測熒光”強度來確定被測分子的濃度。所得到的數據經計算機處理后，用配套軟件分析即可直接用來判斷結果。

2 液相芯片的特點

2.1 高通量、速度快

可在同一反應體系中放入不同編碼的微球，每種微球對應一種檢測物質。利用Luminex公司開發的3色熒光編碼技術，10μl微量標本可檢測多達500個指標，提高了標本的利用率，實現了樣品的高通量檢測。整個雜交反應在液相環境中進行，使得雜交反應動力學顯著加快，效率顯著提升，大大地縮短了雜交時間，最快可達10 000測試/h。

2.2 特異性好，靈敏度高

微球的表面積大，先通過特異性的PCR將靶分子數量擴大，再通過特異性的探針與目標分子雜交，每個微球能結合約（1～2）×106個探針分子，反應時熒光信號強；兩束不同激光分別檢測微球上的分類熒光信號和報告基團上的熒光信號，兩種信號同時存在時才可以檢測分析。微球表面還可以進行化學處理，進一步地提高反應的特異性。

2.3 應用范圍廣、重復性好

在微球表面上包被不同的抗原、抗體、細胞因子、核酸等生物分子，便可檢測相應的目標物；可以應用商品化檢測試劑盒或者根據檢測物質的不同特點，利用分子雜交原理自行設計方案。液相芯片技術相比于以往固相芯片技術，降低了固相芯片在大分子檢測時受空間效應、表面張力等很多反應動力學的干擾，并且增加了檢測結果的穩定性，提高了檢測樣品的重復性。檢測的重復性可以達至90%以上，線性范圍寬，動態范圍可達4～6 個數量級。

2.4 操作簡便、經濟實惠

應用液相芯片一次檢測就能完成多份樣品多個指標同時檢測，節約了試劑，耗材及勞動力，降低了樣品檢測的成本，提高了分析的效率，液態芯片在大大提高檢測效率的基礎上，檢測試劑比用其他方法檢測相同指標時價格更實惠。檢測儀器和消耗品相對固相芯片技術也便宜。

3 液相芯片在動物病原微生物檢測中應用

3.1 液相核酸芯片

朱海紅等（2007）基于懸浮芯片技術建立的狂犬病毒等56種病原微生物的高通量檢測微生物診斷技術平臺，高通量、快速、可靠且經濟，為突發傳染病的病原體診斷提供技術儲備。詹愛軍等（2010）建立了可以同時檢測鹿流行性出血熱病毒、阿卡斑病毒、藍舌病病毒和水泡性口炎病毒等4 種蟲媒病的快速高通量液相芯片技術，這四種蟲媒病是世界動物衛生組織（OIE）規定的法定報告動物疫病和我國農業部規定的一、二類動物傳染病，為防止此類疾病進入我國以及監控其在我國的流行提供了重要的技術儲備。張曉娜等（2012）成功建立了檢測H5、H7、H9禽流感，新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒等6種病毒的液相芯片檢測方法，敏感性、特異性和穩定性均較好。王晶鈺等（2012）成功建立了PPV、PCV2 二重xMAP檢測方法，該方法與標準 PCR檢測符合率為100%，該檢測技術可用于出入境檢疫和獸醫臨床檢驗。王政等（2017）建立蝦桃拉病毒、黃頭病毒和白斑病毒檢測方法，檢測靈敏度高分別為401.5、251.5和75.2 copies。除了檢測病毒，近年來也有學者采用液相基因芯片進行細菌、真菌等臨床鑒定。

3.2 液相蛋白芯片

盧愛桃等（2008）建立了一種可以同時檢測猴T淋巴細胞白血病毒I型、猴單純皰疹病毒兩種病毒抗體的液相芯片技術，對比ELISA與流式熒光微球檢測結果，證明用熒光微球對猴血清進行檢測，不僅比ELISA法快速省時，而且靈敏度比間接ELISA法高出～100倍。劉志玲等（2012）用xMAP蛋白芯片技術建立牛地方流行性白血病的檢測方法，實驗結果顯示對牛白血病病毒抗體的檢測敏感性可達119.7 ng/μl；批內、批間的變異系數均小于10%，試驗重復性良好；所制備的偶聯微球芯片保存3個月，其檢測結果無顯著差異，穩定性好。蔡月琴等（2013）應用制備的兔IgG、IgM和IgA液相芯片建立的xMAP方法，對實驗兔血清進行檢測，檢測結果與ELISA結果一致，提示該方法可應用于實驗兔血清的IgG、IgM和IgA半定量檢測。

4 液相芯片的應用前景

液相芯片技術可用于多種生物分子（核酸和蛋白質）檢測，但是這項技術仍存在著一些難點和缺陷，如不同探針間溫度的差異、檢測血清中特異性抗體時檢測的背景值高對實驗造成干擾等。我們可以相信，隨著研究的不斷進展和深入，這些缺陷會很好的得到解決，今后這一技術會成為臨床診斷、基礎研究、新藥開發、司法鑒定、食品衛生監督、生物武器防范等領域一項重要的分析檢測技術，將大大推動生命科學的研究與發展。