肝癌衍化生長因子對大腸癌早期血管形成的調節作用研究

喬鎮 金牡丹 周嘉鶴 沈忠

大腸癌的發病率在全球常見惡性腫瘤中排第4位[1]。近年來，我國大腸癌病死率呈上升趨勢[2]。根據大腸癌發病危險因素采取相應的干預措施，對降低大腸癌發病率和提高早期診斷率有重要意義[3]。肝癌衍化生長因子（hepatoma-derived growth factor，HDGF）是一種最初從條件培養的Huh-7肝癌細胞系中提取出來肝素結合蛋白[4-5]。HDGF可能通過誘導血管內皮生長因子（VEGF）的產生促進血管生成，從而參與腫瘤的發生、發展過程。許多體外腫瘤細胞系、原發細胞（血管平滑肌和血管內皮細胞）[6]及體內多種腫瘤細胞，如胃癌[7]、膽囊癌[8]、胰腺癌[9]、食管癌[10]、腎癌[11]、肺癌[12]細胞等均可表達 HDGF，誘導腫瘤血管形成，促進腫瘤發生、發展。微血管密度（microvessel density,MVD）是反映腫瘤血管形成程度的指標，也是影響結腸癌預后的因素之一[13]?；诖?，本研究旨在探討HDGF在大腸癌發生、發展過程中對血管形成的調節作用及其在大腸癌早期診斷中的意義，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 組織標本 選取2010至2012年在杭州市第三人民醫院行手術切除治療的50例大腸癌組織及對應的癌旁正常腸黏膜組織（距癌周＞10cm）標本。所有病例手術前均未接受放射、化學治療及免疫抑制劑治療，其中男32 例，女 18 例；年齡 27～83（56.35±29.2）歲。另擇同期在杭州市第三人民醫院行結腸鏡下摘除術的25例腺瘤性息肉組織標本。所有標本均經病理學檢查確診，液氮冷存后轉入-80℃冰箱保存。

1.2 試劑和儀器 鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、sunpoly-HII/HRP兔、鼠通用型試劑盒均采購自上海太陽生物技術有限公司，兔抗人HDGF單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。TRIzol試劑、HDGF、GAPDH引物均購自美國Invitrogen公司，熒光定量試劑、多聚胸腺嘧啶引物購自日本Takara公司。PCR引物由上海英駿生物公司合成。GAPDH正義鏈∶5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反義鏈∶5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。 HDGF 正 義 鏈 ∶5′-GAGGGTGACGGTGATAAGAA-3′，反義鏈∶5′-GAAACATTGGTGGCTACAGG-3′。臺式離心機為美國Eppendorf公司產品，實時PCR系統為美國Bio-Rad公司產品，PCR擴增儀為美國Applide Biosystem公司產品，2100生物分析儀為德國Agilent公司產品。其余實驗材料及試劑取自杭州市第三人民醫院病理中心實驗室。

1.3 方法

1.3.1 HDGF、VEGF蛋白表達檢測 采用免疫組化法。制備大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織標本的3μm連續切片，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，高溫高壓抗原修復；SP法染色（按說明書操作），DAB顯色，蘇木精復染；脫水、透明、封片。采用已知陽性片作陽性對照，PBS分別代替 HDGF、VEGF、CD34單克隆抗體作為陰性對照。HDGF蛋白以細胞質和（或）細胞核著棕黃色為陽性染色，≥90%的細胞質和細胞核均為陽性染色為表達陽性。VEGF蛋白以細胞質和（或）細胞核著棕黃色為陽性染色，每張切片陽性細胞數≥10%為表達陽性。

1.3.2 MVD檢測 用抗體CD34標記新生血管，每張切片首先在低倍鏡（×100）下挑選MVD最高的區域，然后再高倍鏡（×400）下，隨機計數5個視野的被CD34染成棕黃色的血管數目，取平均值作為該病例的MVD值。

1.3.3 HDGF mRNA表達檢測 采用熒光定量RT-PCR法。受經費限制，采用隨機數字表法選取大腸癌及對應正常腸黏膜組織標本、腺瘤組織標本各10例進行熒光定量RT-PCR檢測。大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織的總RNA提?。喝〗M織標本約100mg研磨至粉末，加入TRI－zol裂解液1ml混勻，轉入1.5ml EP管。每升TRIzol加氯仿0.2 L，緊閉離心管，劇烈搖蕩15s，室溫放置2min，離心（4°C，30min）；取上層水相轉入新的離心管，等比例加入異丙醇，上下顛倒10次后，-20°C沉淀30min以上，離心（4°C，30min）；棄上清液，加入 1ml的 75%乙醇溶液，混勻，再次離心（4°C，10min）；棄上清液，超凈臺內室溫干燥10min。將RNA溶于30μl RNase-free水中，-80°C保存。取1μl，利用Agilent 2100觀察RNA質量，并用紫外分光光度計測定抽提RNA濃度、純度。逆轉錄合成cDNA和實時qPCR反應：取1μg總RNA按照逆轉錄第一鏈合成試劑盒說明書進行cDNA的合成。RT-PCR法按照試劑盒說明書進行操作，檢測各模板的Ct值。以正常腸黏膜組織GAPDH為內參，計算大腸癌、腺瘤組織的ΔΔCt值。采用 2-ΔΔCt法計算大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達水平。

1.4 觀察指標 （1）比較大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HGDF、VEGF蛋白表達情況及MVD；（2）分析大腸癌組織HDGF、VEGF蛋白表達情況與MVD的關系；（3）比較大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達水平。

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HGDF蛋白表達情況比較 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HGDF蛋白表達陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05），大腸癌組織HDGF蛋白表達陽性率最高，達80.0%，正常腸黏膜組織僅為8.0%，腺瘤組織介于兩者之間，為72.0%，見圖 1、表 1。

圖1 大腸癌組織HDGF蛋白表達情況（SP法染色；a:×100；b:×400）

2.2 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織VEGF蛋白表達情況比較 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織VEGF蛋白表達陽性率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），大腸癌組織VEGF蛋白表達陽性率最高，為86.0%，腺瘤組織為40.0%，正常腸黏膜組織最低，為4.0%，見圖2、表2。

表1 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HGDF蛋白表達情況比較[例（%）]

圖2 大腸癌組織VEGF蛋白表達情況（SP法染色；a:×100；b:×400）

表2 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織VEGF蛋白表達情況比較[例（%）]

2.3 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織MVD比較 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織MVD分別為25.28±4.14、15.24±4.73、12.48±5.81，3 者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。大腸癌、腺瘤組織MVD均高于正常腸黏膜組織（均P＜0.05），大腸癌組織MVD亦高于腺瘤組織（P＜0.05）。

2.4 大腸癌組織HDGF、VEGF蛋白表達情況與MVD的關系分析 HDGF陽性表達的大腸癌組織MVD為26.29±3.43，陰性表達的為 21.60±2.36。VEGF 陽性表達的大腸癌組織MVD為26.22±3.16，陰性表達的為20.00±2.64。HDGF、VEGF蛋白陽性表達者MVD均高于陰性表達者（均P＜0.05）。

2.5 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達水平比較 見表3。

表3 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGFmRNA表達水平比較

由表3可見，大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），大腸癌組織HDGF mRNA表達水平高于腺瘤、正常腸黏膜組織（均P＜0.05），腺瘤組織HDGF mRNA表達水平高于正常腸黏膜組織（P＜0.05）。

3 討論

大腸癌一直是發病率位居前列的國民常見惡性腫瘤之一[14]，早期篩查、診斷大腸癌對改善患者預后意義重大。HDGF是一種肝素結合蛋白，最初是從條件培養的肝癌細胞系中提取出來的。研究發現，HDGF與多種消化道腫瘤的發生、進展、預后有關。HDGF在腫瘤的血管形成中起重要作用，作為一種促有絲分裂原，其具有促進內皮細胞增殖、誘導新生血管形成的作用。HDGF參與了血管形成過程，以及多種腫瘤的發生、發展過程，其機制可能是HDGF具有與DNA結合的功能，可參與細胞增殖、分化，從而導致腫瘤浸潤、轉移。

本研究結果顯示，大腸癌組織HDGF表達陽性率和MVD均高于腺瘤、正常腸黏膜組織，在大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織中呈遞減趨勢，這提示HDGF的高表達可能與大腸癌的癌前病變有關，參與大腸癌的早期病理改變。本研究還發現，HDGF陽性表達的大腸癌組織MVD明顯高于陰性表達者，這說明HDGF可促進大腸癌新生血管形成，參與腫瘤的血行轉移，為其提供條件。而腫瘤是否發生轉移對患者的預后起關鍵作用，發生轉移的腫瘤患者預后不良。

VEGF是目前已知的關鍵的促進血管形成的因子之一，在腫瘤的血管形成過程中起重要作用，涉及各個系統腫瘤[15]。本研究觀察到，大腸癌組織VEGF表達陽性率高于腺瘤、正常腸黏膜組織，在大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織中亦呈遞減趨勢，這表明VEGF的高表達參與促進腫瘤的早期發生、發展過程。有動物實驗研究發現，HDGF可誘導VEGF表達，抗血管內皮生長因子中和抗體可抑制過度表達HDGF的腫瘤的生長[6]。

此外，本實驗又從分子生物學角度分析并比較了大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達水平。結果發現，大腸癌組織HDGF mRNA表達水平高于腺瘤、正常腸黏膜組織，腺瘤組織HDGF mRNA表達水平高于正常腸黏膜組織。這提示臨床可以HDGF mRNA為觀察指標，以RT-PCR為輔助檢查手段，幫助大腸癌的早期診斷。RT-PCR是一種經濟有效的體外擴增技術，取少量的標本即可進行成倍擴增表達，如將此技術應用于臨床大腸癌早期診斷，有助于指導臨床的早期治療，改善患者預后。

綜上所述，HDGF在大腸癌組織中高表達，通過與VEGF協同作用，促進大腸癌早期血管形成。HDGF表達在大腸癌惡變過程中呈遞增趨勢，以其為檢測指標有助于大腸癌的早期診斷。