新生小鼠心臟再生機制的研究進展

陳秉瑞 范燚 綜述 王連生,2 審校

(1.南京醫科大學研究生院，江蘇 南京 210000； 2.南京醫科大學第一附屬醫院心內科，江蘇 南京 210029)

1 背景

長期以來，心臟被認為是有絲分裂后的器官,心肌細胞被認為不具有分裂或再生能力。近年在斑馬魚和新生小鼠中發現了心臟再生能力，對于心臟損傷治療的研究來說無疑是突破性的進展，對于哺乳動物甚至人類的心臟修復有著重要的提示意義。新生小鼠的心臟再生有多方面因素參與其中：DNA甲基化、miRNA(小RNA)、關鍵蛋白、信號通路、蛋白激酶等都在新生小鼠心臟再生中發揮重要作用?；蛘{節機制中，DNA的甲基化在器官發育、組織分化和細胞特化等方面發揮雙向調控作用。其中，啟動子區域的DNA甲基化與轉錄抑制存在密切聯系[1]。miRNA對基因表達有著重要的影響，可以協同作用于重要細胞通路中的多種成分，影響細胞表型。多個miRNA簇在小鼠發育早期表達，維持組織特異性，參與祖細胞識別。蛋白激酶誘導蛋白質磷酸化，激活多條信號通路和多種生物過程，在生物的生長發育中有著至關重要的作用。

2 DNA甲基化參與出生后心肌細胞轉錄抑制

出生后1～7 d，在與新生小鼠心血管系統發育有關的基因的啟動子中，存在著許多差異性甲基化區域。這些區域中的絕大多數都會在生后第7天出現DNA的甲基化增加[2]。同時，新生小鼠心臟的再生能力在生后第7天出現明顯的下降，這提示，DNA的甲基化很可能抑制了心肌細胞的再生能力。研究表明，在生后7 d甲基化修飾增加的基因主要參與了心臟的發育，并且是多種轉錄調節因子的作用目標。例如，心臟特異性肌增強因子Mef2可以與GATA4和Tbx5協同作用，促使新生成的纖維細胞向心肌細胞樣細胞轉化[3]。Tead4上調Hif1α，刺激缺血后的血管發育和心臟恢復[4]，這些作用都有助于促進心臟再生。生后7 d時，Mef2和Tead4都出現大量的甲基化富集區，使其轉錄受到抑制，表達減少，心肌細胞增殖能力隨之下降。

3 miRNA參與新生小鼠心肌細胞增殖再生

3.1 miRNA 302-267簇抑制Hippo通路

miRNA 302-267簇表達于胚胎形成早期，參與維持胚胎期心肌細胞持續、高水平的增殖活動，最終引起心臟增大，在出生后心臟中不表達。然而，通過構建過表達的小鼠模型，在出生后心臟中持續再表達該簇，該簇可以重新激活心肌細胞進入細胞周期，促進心肌細胞的增殖再生，延長心肌細胞去分化狀態，抑制成熟心肌細胞表型，促進心力衰竭的發生。此外，Ying等在成年小鼠心肌梗死后通過尾靜脈注射該簇，使其在心臟內聚集，觀察到心肌細胞出現了去分化現象，增殖增加，凋亡減少[5]。

Hippo信號通路是經典而保守的調節器官大小和細胞增殖的信號通路，其主要成分包括上游哺乳動物不育系20樣激酶(MST)、腫瘤抑制因子(LATS)與下游YAP蛋白等，抑制MST和LATS導致YAP進入細胞核激活基因表達，促進心肌細胞增殖[6]。miRNA 302-267簇通過部分地作用于Hippo信號通路的多種成分來發揮促進心肌細胞增殖的效應。研究表明，miRNA 302-267簇過表達導致MST1、LATS2的表達下降；敲除該基因簇則會使前述基因表達增加，從而增加YAP蛋白的磷酸化，維持YAP蛋白的無活性形式，減少其向胞核的轉移。以上證據說明miRNA 302-267簇通過抑制這些基因來抑制Hippo通路的活性，從而發揮促進心肌細胞增殖的功能。

3.2 miRNA-204抑制核轉錄因子Jarid2

miRNA-204在腫瘤形成、眼的發育、糖尿病及肺動脈高壓等領域被廣泛研究，而在心臟領域研究甚少。miRNA-204參與調節人類心臟祖細胞的增殖和分化，可能對心肌細胞增殖再生產生影響。另有研究表明，過表達miRNA-204可以抑制核轉錄因子Jarid2的表達，從而上調細胞周期蛋白基因CycD1的表達，引起新生小鼠心肌細胞增殖[7]。

4 蛋白質的作用

4.1 成纖維細胞生長因子10調節心肌細胞增殖

成纖維細胞生長因子(FGF)10是成纖維細胞生長因子家族(FGFs)的成員，通過與成纖細胞生長因子受體(FGFR)相互作用，參與促進損傷修復、毛發生長、干細胞增殖分化、腫瘤及器官發育等多種生命過程。在小鼠心肌損傷后，持續過表達FGFR，可以促進新生血管形成，改善損傷區血液循環，對心功能產生保護性作用。此外，FGF10還參與心外膜上皮間質細胞的轉化：作用于FGFR2b，促使心外膜上皮間質細胞轉化成纖維細胞，并由此促進心臟外基質形成，有利于心肌細胞增殖[8]。新生小鼠心室切除后，心外膜細胞向損傷區發生擴展，并對治療性FGF10處理能產生增殖反應[9]。但是，雖然FGF10在正常心臟中大量表達，在未損傷的心臟中過表達FGF10則不會影響心肌細胞的數量。這說明，FGF10能在一定程度上促進心肌細胞增殖反應，但其單獨作用尚不能啟動心肌細胞重新進入細胞周期。

4.2 GATA4上調FGF16表達

GATA家族成員屬于鋅指轉錄因子家族，包含一個或多個高度保守的鋅指-DNA結合域，能特異性結合在含HGATAR的DNA結構域上。脊椎動物包含6種GATA因子，其中GATA4在心臟發育中發揮重要作用。GATA4參與調節多種心臟特異性功能基因，這些基因對新生心臟發育尤為重要,參與心肌細胞的分化、遷移、肥大、纖維化和存活等重要的生命過程。近來研究表明特異性敲除心肌細胞中的GATA4會導致新生心臟損傷后無法啟動心肌再生程序，出現纖維疤痕修復。在進一步的研究中，利用腺相關病毒AAV9在心臟中過表達FGF16，可以部分地挽救GATA4敲除引起的表型，證明了GATA4通過直接上調FGF16表達發揮效應[10]。這說明GATA4/FGF16軸參與了新生心臟再生的調節。此外，FGF2在非心肌細胞中表達，能夠促進心肌肥大、瘢痕修復[11]。FGF16可以通過競爭性結合FGFR1c來抑制FGF2的功能，從而抑制心肌肥厚和纖維化[12-13]，促進心肌損傷修復再生。

4.3 Meis1抑制新生心臟再生

Meis1屬于TALE同源結構域轉錄因子家族，是胚胎發育期心臟分化的中心調節因子[14]，參與維持心臟的正常發育，但其在心肌細胞周期中的作用尚不清楚。研究發現，敲除Meis1會影響細胞周期活性和生后心肌細胞的胞核形成，同時又不會增加心肌細胞凋亡。另一方面，在小鼠中過表達Meis1不會降低心臟質量，但會抑制新生心臟心肌細胞的再生，同時上調周期蛋白依賴性激酶抑制因子[15]。這說明Meis1過表達會阻滯未成熟心肌細胞的細胞周期。雖然目前還不能說明Meis1 激活的具體機制，但總體來說，Meis1表達伴隨3種Hox基因上調，以穩定其DNA結合能力，增強其轉錄活性。

4.4 松弛素上調心臟轉錄因子并增加細胞存活

松弛素(RLX)是一種心臟激素，由心肌細胞產生，能夠與特異性心肌受體結合，在新生階段的心臟發育中發揮促進作用。研究表明，RLX應用于新生小鼠心臟，可以上調GATA4、Nkx2-5等心臟轉錄因子[16]。這些轉錄因子在心臟成熟期間可以誘導心臟特異性的結構基因的表達，并通過發揮抗凋亡作用增加細胞存活，從而促進心肌再生。但是，RLX對心肌細胞的作用是雙相的。在小鼠出生后24 h內，RLX促進心肌細胞增殖；24～48 h，RLX會降低心肌細胞增殖的速率；而在出生48 h后，RLX就無法影響心肌細胞增殖[17]。

5 利用蛋白激酶治療心臟損傷的嘗試

5.1 神經調節蛋白1與ERBB家族的協同作用

神經調節蛋白1(NRG1)及其酪氨酸激酶受體ERBB4、ERBB3和ERBB2在心臟發育中發揮重要作用[18-20]。其中ERBB2主要在胚胎、生后和新生心臟中表達，并促進心肌細胞增殖[18]。ERBB2并不與配體結合，但對其他ERBB受體與配體的結合具有穩定作用，從而增強配體誘導的受體信號。在心肌中，ERBB2主要與ERBB4協同作用。Ganapathy等[21]在小鼠出生后的一個月內，每天給予小鼠皮下注射rNRG1 100 ng/g，發現NRG1與ERBB2結合后， 會上調細胞外調節蛋白激酶和蛋白激酶B，下調GSK3β，從而調節心肌細胞的肥大、去分化和增殖。其中，細胞外調節蛋白激酶上調會抑制心肌細胞去分化，減少肥大反應；蛋白激酶B上調則會增強心肌細胞去分化，減少肥大反應；GSK3β下調增加β連環蛋白聚集和RUNX1表達，促進依賴β連環蛋白的細胞周期活性。ERBB2對GSK3β的抑制作用可以使心肌細胞在7 d齡后仍然保持穩定的去分化和增殖能力，從而延長出生后心臟再生時間窗。這些都有助于促進心臟再生，同時不會引起其他臟器的生長。

5.2 D492上調自噬促進損傷修復

自噬過程參與細胞生長、分化和細胞物質的平衡，腺苷酸依賴的蛋白激酶(AMPK)通路和mTOR通路是調節細胞自噬的重要信號通路。AMPK通路可以通過促進UlK1的磷酸化直接調節自噬，或者抑制mTOR通路來間接調控，mTOR通路則通過抑制UlK1負性調節自噬[22-23]。D492是AMPK選擇性激動劑，已被證明可在人類前列腺腫瘤PC3細胞中引起自噬。Yang等在新生小鼠原代心肌細胞中誘導氧糖剝奪和復氧OGD/R，并用成年小鼠構建了心肌缺血再灌注損傷模型[24]。給予心肌細胞D492處理后，D492顯著地上調AMPKα磷酸化，下調p70S6和4EBP1的磷酸化，從而激活AMPK通路，抑制mTOR通路，引起細胞自噬，減少OGD/R導致的心肌細胞凋亡，從而發揮了保護性作用。在成年小鼠的缺血再灌注損傷模型中，D492也通過同樣的途徑，減少心肌細胞受到的缺血性損傷。

6 結論與展望

近年來的研究表明，低等脊椎動物和部分新生的哺乳動物的心臟及其他內臟損傷后可以完全再生。成人的心肌細胞可以較低的速率再生，但這種低度的再生并不能修復心臟的缺血性損傷。心臟在發育過程中關閉自身再生的能力，從進化的角度而言，其優勢尚不為人所知。心臟再生治療已發展出多種手段，包括細胞替代療法、內源性祖細胞群激活、心肌細胞的細胞周期重啟和細胞系直接重編程；但是由于成年患者的內源性生理限制和翻譯屏障，這些治療方法的效果都不夠理想。目前的研究表明，蛋白激酶能夠增強內源性再生能力，促進新生和成年小鼠的心臟損傷修復，向臨床轉化的前景尤為可觀，值得繼續深入地研究。