響應面法優化低高級醇高氨基氮的黃酒釀造工藝

曹 鈺 ，潘慧青 ，陸 健 ，謝廣發

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；4.中國紹興黃酒集團有限公司國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000）

黃酒是我國的特有酒種，以谷物（通常是糯米/粳米）為主要原料，利用酒藥和麥曲或米曲所含的豐富的微生物和酶為糖化發酵劑，經雙邊濃醪發酵釀造而成的發酵原酒[1]。

高級醇是各類酒的主要香味和口味物質之一。適量的高級醇能使酒體豐富，口味協調，給人以醇厚的感覺。若高級醇含量過高，則對人體有毒害作用[2]。相比于其他發酵酒類而言，各種黃酒中高級醇的含量較多，也是導致黃酒容易“上頭”的主要原因之一[3]。在黃酒發酵過程中影響高級醇生成的因素有很多，主要包括：酵母菌種[4-5]、釀酒原輔料[5-6]、麥曲[7]、發酵工藝[8]（溫度、營養物質主要是氮源含量的控制、接種量及增殖倍數）。但從本質上來說，高級醇的形成不外乎2種途徑[1]：第一，若氨基酸缺失，酵母菌通過Harris途徑自身合成必需氨基酸，同時形成的α-酮酸中間體，被還原形成相應的高級醇；第二，若氨基酸含量過多，酵母菌通過Ehilich降解途徑分解氨基酸，生成原氨基酸少一個碳的高級醇。由此可見高級醇的形成與發酵過程中的氨基酸代謝密切關聯[9]，吳春在研究黃酒風味物質的形成及變化過程中證實發酵醪液中高級醇含量增加階段與氨基酸的含量大量增加期有明顯的一致性[10]。張興亞研究發現黃酒釀造中，隨著麥曲量的增加、后酵溫度的升高，高級醇與氨基酸態氮的變化趨勢相同，都呈升高趨勢[8]。

氨基酸在黃酒釀造過程中既為微生物提供了豐富的營養物質，也是很多風味物質的前體物質，并能賦予酒體豐富的味覺層次。在整個黃酒釀造過程中氨基酸的含量是一個動態過程，一方面酵母菌等微生物的自身生長繁殖需要消耗一部分氨基酸，另一方面蛋白質在多種蛋白酶肽酶的作用下不斷水解為氨基酸和小肽。黃酒行業采用氨基酸態氮來反映氨基酸及小肽的總體水平，氨基酸態氮含量是評價黃酒質量等級重要指標[11]，國標對不同類型、不同等級黃酒中的氨基酸態氮含量有明確的要求。而黃酒的氨基酸態氮的形成同樣也受到原輔料、麥曲中的酶系、發酵工藝條件等復雜影響[12]，且影響因素之間可能存在著交互作用。

隨著人們對黃酒品質和飲用健康性要求的不斷提高，降低黃酒中的高級醇含量并同時保留高等級標準氨基氮的優質黃酒受到極大的關注。作者前期已經進行黃酒釀造工藝，包括接種量、前酵溫度、后酵溫度、后酵時間[13]等單因素對氨基酸態氮的影響研究。在綜合文獻資料和前期單因素實驗結果的基礎上，選取對高級醇和氨基酸態氮影響較大的3個因素：前酵溫度、酵母接種體積分數及后酵溫度進行Box-Behnken實驗設計，探討降低高級醇質量濃度并提高氨基酸態氮質量濃度的最優釀造工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Saccharomyces cerevisiae N85，由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供；糯米，購于無錫市華潤萬家超市；生、熟麥曲，均由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供；乙腈，賽默飛世爾科技有限公司產品；甲醇，北京白靈威科技有限公司產品，色譜純，其他試劑均為分析純。

UV-2100紫外分光光度計，Unic公司產品；凱氏定氮儀K2300，瑞典FOSS分析儀器有限公司產品；固相微萃取頭、手動進樣手柄，美國Supelco公司產品；Agilent GC7890A型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司產品。

1.2 常規黃酒釀造

采用3 L的三角瓶發酵600 g糯米，釀造工藝流程如圖1。

圖1 黃酒釀造工藝流程Fig.1 Diagram of Chinese rice wine brewing

1.3 響應面優化實驗

實驗采用自然浸米，發酵時間為21 d，選取前酵溫度、酵母接種體積分數和后酵溫度3個工藝條件作為影響因素進行Box-Behnken響應面分析和優化，因素水平設計見表1，響應面實驗為同一批次進行，所用麥曲經四分法取樣測得酸性蛋白酶活在112～118 U/g之間。

表1 響應面因素設計水平表Table 1 Factors and 3 level value of response surface methodology

1.4 常規指標的測定

酒精度、總糖、總酸、氨基酸態氮及非糖固形物的測定方法按照GB/T 13662-2008《黃酒》中規定方法執行[11]?？偟臏y定采用凱氏定氮法，參照凱氏定氮儀說明書。高級醇質量濃度的測定參考李童[12]等人。

2 結果與分析

2.1 Box-Behnken實驗結果及方差分析

根據黃酒釀造工藝對氨基酸態氮和高級醇質量濃度影響的單因素實驗結果[13]，前酵溫度、后酵溫度及酵母接種量3個因素的影響相對較大。選取前酵溫度26、28、30℃，酵母接種體積分數3%、5%、7%，后酵溫度13、15、17℃為影響因子水平，以高級醇含量和氨基酸態氮質量濃度為實驗指標，進行Box-Behnken響應面分析，實驗設計結果見表2。

利用軟件Design-Expert8.0.6對表2進行多元回歸擬合，分別獲得高級醇質量濃度Y1對自變量前酵溫度（A），酵母接種量（B）和后酵溫度（C）的三元多次回歸方程和氨基酸態氮質量濃度Y2對自變量的二元多次回歸方程如下。

Y1（高級醇）=410.33+33.05A+25.86B+21.64C-1.00AB+5.08AC+6.64BC-10.56A2-29.28B2-20.19C2-7.62A2B-3.09A2C-5.79AB2，R2=0.99。

Y2（氨基酸態氮）=0.92+0.08A-6.250×10-3B+0.046C-0.017AB-0.022AC+2.500×10-3A2-0.035B2-0.025C2，R2=0.99；

回歸診斷顯示，Y1和Y2回歸方程的決定系數（R2）均為 0.99，信噪比（Adequate Precision）分別為81.76和22.88，且二元多次回歸方程式的失擬值方差分析不顯著（P=0.28＞0.05），這些都表明方程的擬合度與可信度很高，誤差極小，能夠用模型分別對高級醇質量濃度和氨基酸態氮質量濃度進行預測和分析。

表2 Box-Behnken實驗設計結果Table 2 Experiment design and results of Box-Behnken

由表3高級醇回歸模型方差分析可知，對高級醇的質量濃度所建立的回歸模型極顯著（P=0.001 4＜0.01），因素 A、B、 C、A2、B2和 C2對高級醇質量濃度的影響極為顯著（P＜0.01）；AC，BC，A2B 及 AB2對高級醇質量濃度的影響為顯著（P＜0.05）；因素AB和A2C對高級醇質量濃度的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 高級醇的方差分析表Table 3 Variance analysis of Box-Behnken design about higher alcohols

表4 氨基酸態氮的方差分析表Table 4 Variance analysis of Box-Behnken design about amino nitrogen

氨基酸態氮回歸模型方差分析見表4，對氨基酸態氮的質量濃度所建立的回歸模型極顯著 （P=0.000 3＜0.01），因素A對氨基酸態氮的影響最為顯著，其次因素 C 的影響極為顯著（P＜0.01）；AC，C2對氨基酸態氮質量濃度的影響為顯著（P＜0.05）；因素B、AB、BC和A2對氨基酸態氮質量濃度的影響不顯著（P＞0.05）。

2.2 因素交互作用的響應面分析

2.2.1 前酵溫度、酵母接種量、后酵溫度的交互作用對高級醇的影響 前酵溫度和酵母接種量對高級醇的交互作用不顯著，如圖2所示。當前酵溫度不變時，隨著酵母接種體積分數的增大，高級醇的質量濃度基本沒有發生較大改變。同樣，當酵母接種體積分數恒定時隨著前酵溫度的增加使得高級醇質量濃度也未發生顯著變化。

前酵溫度與后酵溫度對高級醇的交互作用明顯。當前酵溫度不變時，隨著后酵溫度的增大使得高級醇質量濃度增加；同樣，當后酵溫度保持不變時隨著前酵溫度的增大也使得高級醇質量濃度增加。

圖2 前酵溫度、酵母接種體積分數與后酵溫度交互作用對高級醇的影響Fig.2 Response surface plots of effect of interaction between primary fermentation temperature and yeast inoculation size and post-fermentation temperature on higher alcohols in Chinese rice wine

酵母接種體積分數和后酵溫度對高級醇的交互作用顯著。當酵母接種體積分數不變時，隨著后酵溫度的不斷增大，高級醇質量濃度呈現先增多后稍微降低的趨勢；同樣，當后酵溫度保持不變時，隨著酵母接種體積分數的增大而高級醇質量濃度呈現先增多后降低的趨勢。因此，該條件下2因素的交互作用對高級醇質量濃度影響較為顯著。

2.2.2 前酵溫度、酵母接種體積分數、后酵溫度的交互作用對氨基酸態氮的影響 前酵溫度和酵母接種體積分數對氨基酸態氮的交互不顯著，見圖3。當前酵溫度不變時，隨著酵母接種體積分數的增大，氨基酸態氮的質量濃度基本沒有發生改變；僅當酵母接種體積分數恒定時隨著前酵溫度的升高使得氨基酸態氮質量濃度增多，此時前酵溫度起到主要影響作用。

圖3 前酵溫度、酵母接種體積分數與后酵溫度的交互作用對氨基酸態氮的影響Fig.3 Response surface plots of effect of interaction between primary-fermentation temperature and yeast inoculation size and post- fermentation temperature on amino nitrogen in Chinese rice wine

前酵溫度與后酵溫度對氨基酸態氮的交互作用明顯。當前酵溫度不變時，隨著后酵溫度的增大使得氨基酸態氮質量濃度增加；同樣，當后酵溫度保持不變時隨著前酵溫度的增大也使得氨基酸態氮質量濃度增加。

酵母接種體積分數和后酵溫度對氨基酸態氮的交互作用不顯著。當酵母接種體積分數不變時，隨著后酵溫度的不斷增大，氨基酸態氮質量濃度呈現先增多后稍微降低的趨勢；但當后酵溫度保持不變時，隨著酵母接種體積分數的增大而氨基酸態氮質量濃度幾乎未發生變化。因此，該條件下因素后酵溫度對氨基酸態氮質量濃度影響較為顯著。

2.3 驗證性實驗

用軟件Design-Expert 8.0.6中的“Optimization”選項進行分析得出優化結果，即同時獲得較低的高級醇質量濃度及較高的氨基酸態氮質量濃度的發酵條件為：前酵溫度30℃，酵母接種體積分數3%和后酵溫度13℃，高級醇質量濃度和氨基酸態氮質量濃度的計算預測值分別為343.33 mg/L和0.95 g/L。

采用優化的工藝條件（前酵溫度30℃、酵母接種體積分數3%和后酵溫度13℃）進行發酵實驗，同時采用優化前發酵條件（前酵溫度28℃、酵母接種體積分數5%、后酵溫度15℃）作為對比釀造實驗，以進一步驗證該方法的可靠性。分別做3個平行實驗，結果見表5。

表5 實驗設計的結果驗證Table 5 Validation of the experimental design results

優化釀造的黃酒中高級醇質量濃度平均值為355.43 mg/L，氨基酸態氮的平均值為0.98 g/L，驗證實驗的結果與理論預測值誤差小于3.50%，與優化前相比高級醇降低了12.30%，氨基酸態氮提高了8.90%，其他黃酒理化指標均在正常范圍之內。因此，采用響應面方法優化得到的最優工藝條件具有實際意義與實用價值，既能有效降低黃酒的高級醇質量濃度，又可以提高氨基酸態氮質量濃度，確保黃酒的飲用安全和品質等級。

3 結語

在黃酒發酵過程中高級醇的形成與氨基酸態氮代謝密切相關，兩者是成品酒中的重要理化指標。高級醇和氨基酸態氮的生成受到多種釀造工藝條件影響，且因素之間可能存在交互作用。在前期單因素實驗的基礎上，選取前酵溫度、酵母接種體積分數及后酵溫度進行Box-Behnken響應面實驗，用Design expert 8.0.6對實驗數據處理分析，并進行響應面分析，探討這3個因素的交互作用對高級醇和氨基酸態氮的影響。

結果表明前酵溫度、后酵溫度以及前酵溫度和后酵溫度的交互作用對高級醇和氨基酸態氮的影響都是極顯著；酵母接種體積分數對高級醇的影響極顯著，但對氨基酸態氮的影響不顯著；酵母接種體積分數與后酵溫度的交互作用對高級醇影響顯著，但對氨基酸態氮影響不顯著；前酵溫度和酵母接種體積分數交互作用對兩者都不顯著。通過響應面回歸分析，確定了降低高級醇質量濃度同時提高氨基酸態氮的最優工藝條件為：前酵溫度30℃，酵母接種體積分數為3%，后酵溫度為13℃。經過驗證實驗，在此條件下釀造的黃酒中高級醇質量濃度為355.43 mg/L，氨基酸態氮質量濃度0.98 g/L，與優化前相比高級醇降低了12.30%，氨基酸態氮提高了8.90%，有助于提高黃酒的品質。