五種生防芽孢桿菌碳源代謝表型分析

張之礬，王開宇，孟 源，劉明競，汪漢成

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五種生防芽孢桿菌碳源代謝表型分析

張之礬1，王開宇1，孟 源1，劉明競1，汪漢成2*

（1.貴州省煙草公司遵義市公司正安縣分公司，貴州 正安 563400；2.貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081）

為了解芽孢桿菌類生防細菌的碳源代謝表型特征，以5種7株生防芽孢桿菌[短小芽孢桿菌（）、地衣芽孢桿菌（）、解淀粉芽孢桿菌（）、飼料類芽孢桿菌（）及枯草芽孢桿菌（）]為對象，采用Biolog代謝表型技術測定了它們的190種碳源代謝表型。結果表明，碳源代謝數量最多的是短小芽孢桿菌，為107種，其他依次為：地衣芽孢桿菌（96種）、解淀粉芽孢桿菌（89種）、飼料類芽孢桿菌菌株4（75種），菌株5（78種）、枯草芽孢桿菌菌株1（74種）、菌株2（70種）。芽孢桿菌菌株在種間和種內的代謝表型間均存在差異，共同代謝的碳源有54種，其中高效代謝的碳源有24種，包括17種多糖類碳源（L-阿拉伯糖、D-海藻糖、D-甘露醇、甘油、D-木糖、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖等）和7種有機酸類碳源（D,L-蘋果酸、L-天冬酰胺酸、檸檬酸、延胡索酸、L-蘋果酸、丙酮酸和5-酮基-D-葡萄糖酸）。研究結果為芽孢桿菌類生防菌劑的開發和利用提供了理論基礎。

生防芽孢桿菌；碳源；代謝表型

芽孢桿菌（）是植物病害生物防治中一類重要的微生物，其種類多、分布廣，是土壤和植物生態環境中的優勢細菌[1-2]。它們大部分呈革蘭氏陽性，G+C含量低、過氧化氫酶陽性、好氧、桿狀，具備運動能力。這類細菌通過分泌抗生素類物質、生態位競爭及誘導植物產生抗性等多種途徑來防治植物病害[3-7]。它們具有廣泛的抗細菌、真菌、病毒和支原體的能力，因而成為生物農藥和功能性生物有機肥研發的重要微生物資源。目前，我國農業部門正在大力推廣藥肥雙減、增施有機肥的農作物耕作制度，煙草上也正在廣泛實施病蟲害的綠色防控。為此，穩定、高效的微生物生防菌劑正在被大力開發與推廣應用。報道較多的有枯草芽孢桿菌（）、解淀粉芽孢桿菌（）、飼料類芽孢桿菌（）、地衣芽孢桿菌（）、短小芽孢桿菌（）等[8-15]。

芽孢桿菌通常在實驗室表現出較好的抑菌效果，而在田間應用中常常防效不穩定，在不同的溫度、氣候、土壤等環境下的防治效果間也存在著差異。影響芽孢桿菌環境適應性和功能發揮的因素有很多，其中營養元素中的碳源尤為重要。它與芽孢桿菌的生存、定殖、芽孢的形成與萌發、次生代謝產物的產生、對植物抗性的誘導等密切相關[16-18]。了解芽孢桿菌的碳源代謝特征對其生防菌劑和次生代謝產物的開發均具有重要的意義。傳統的碳源代謝信息的獲得主要基于室內生理生化反應試驗，需要花費大量的時間和精力，獲得的信息十分有限，且容易出現錯誤，不能動態反應其生長需求和代謝信息。因此，亟待采用新的技術手段對芽孢桿菌類細菌的碳源代謝特征進行快速分析。Biolog微生物代謝表型科技可以快速、高效、準確地進行芽孢桿菌碳源代謝特征分析[19-20]。本研究以前期獲得的生防芽孢桿菌為對象，采用Biolog代謝表型技術對試驗細菌的碳源代謝表型進行分析，并對不同種芽孢桿菌的碳源代謝特征進行比較，旨在為芽孢桿菌類生防菌劑的開發和利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 枯草芽孢桿菌（）菌株1和2、解淀粉芽孢桿菌（）菌株3、飼料類芽孢桿菌（）菌株4和5、地衣芽孢桿菌（）菌株6和短小芽孢桿菌（）菌株7，均由貴州省煙草科學研究院微生物實驗室前期通過Biolog微生物鑒定獲得。

1.1.2 供試培養基與試劑 細菌培養使用牛肉膏蛋白胨固體（NA）和液體培養基（NB）[21]及（BUG+B）培養基。BUG瓊脂、PM 1-2代謝板、接種液IF-0a GN/GP（#72268）和IF-10b GN/GP（#72266）及染料Mix F（#74226）、Mix G（#74227）和Mix H （#74228），均購自美國Biolog公司。PM 1-2代謝板中被測試的碳源信息詳見文獻[19]。凍干脫纖維羊血（B）購自北京友康基業生物科技有限公司。

1.2 芽孢桿菌的碳源代謝表型分析

參照Biolog革蘭氏陽性細菌代謝表型分析的標準程序[19]，測定各芽孢桿菌的代謝表型。將各細菌分別在（BUG+B）平板上活化，按照要求配制PM 1-2的接種液和各細菌新鮮細胞懸浮液，將懸浮液濃度調至81%T（T為Biolog標準濃度單位）。將1.76 mL細胞懸浮液添加至22.24 mL的PM 1和PM 2接種液中，混合均勻，用8通道電動移液器將混勻后的細胞懸浮液添加至PM 1和PM 2代謝板中，每孔100 μL。將接菌后的代謝板置于OmniLog恒溫培養箱中，30 ℃培養48 h，設置OmniLog工作軟件，采用Biolog D5E_OKA_data.exe軟件收集各芽孢桿菌的碳代謝表型數據。根據各細菌代謝的動力學曲線，分析其碳源代謝表型。

1.3 芽孢桿菌碳代謝表型的比較

采用Biolog OL_FM_1.2.exe軟件將各芽孢桿菌的碳代謝表型數據進行轉換。采用Biolog OL_PR_1.2.exe軟件將轉換后數據進行比對分析，選擇峰面積（Area）為對比參數，峰面積越大，說明測試細菌對被檢測碳源的代謝越強。根據峰面積的大小來比較各芽孢桿菌代謝表型的差異。

2 結 果

代謝表型分析檢測了各芽孢桿菌190種（PM 1和PM 2板的A1孔均為陰性對照，碳源種類共計190種）碳源的代謝表型信息。結果如表1-2所示，7株芽孢桿菌的碳源代謝數量間存在差異。代謝數量最多的為短小芽孢桿菌（）菌株7，其代謝碳源數量為107種；其次為地衣芽孢桿菌（）菌株6（96種）和解淀粉芽孢桿菌（）菌株3（89種）；飼料類芽孢桿菌（）菌株4和5代謝的數量分別為75種和78種；代謝數量最少的為枯草芽孢桿菌（）菌株1（74種）和2（70種）。

7株芽孢桿菌均能代謝的碳源有54種，包括：L-阿拉伯糖、N-乙酰葡糖胺、L-脯氨酸、D-海藻糖、D-甘露醇、D-山梨醇、甘油、D-葡萄糖酸、D-木糖、L-乳酸、D-甘露醇、L-谷氨酸、D,L-蘋果酸、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、麥芽糖、胸苷、L-天冬酰胺酸、蔗糖、L-谷氨酰胺、6-磷酸果糖、?-甲基-D-葡萄糖苷、麥芽三糖、腺苷、檸檬酸、M-肌糖、延胡索酸、D-纖維二塘、肌苷、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-蘋果酸、D-阿洛酮糖、L-來蘇糖、丙酮酸、糊精、膠質、D-阿拉伯糖、熊果苷、2-脫氧-D-核糖、麥芽糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、異麥芽酮糖、D-棉子糖、水楊苷、D-塔格糖、松二糖、D-氨基葡萄糖、5-酮基-D-葡萄糖酸、山梨酸、L-鳥氨酸和二羥基丙酮；其中高效代謝的有23種，包括16種多糖和7種有機酸：L-阿拉伯糖、D-海藻糖、D-甘露醇、甘油、D-木糖、D,L-蘋果酸、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-天冬酰胺酸、蔗糖、檸檬酸、延胡索酸、D-纖維二塘、L-蘋果酸、丙酮酸、D-塔格糖、熊果苷、2-脫氧-D-核糖、異麥芽酮糖、D-氨基葡萄糖、5-酮基-D-葡萄糖酸和二羥基丙酮（表1、2）。

除上述共有碳源外，短小芽孢桿菌菌株7代謝的優勢碳源還包括：琥珀酸(PM 1 A5)、D-半乳糖(PM 1 A6)、L-天冬氨酸(PM 1 A7)、D-丙氨酸(PM 1 A9)、D-葡糖醛酸(PM 1 B5)、D,L-α-磷酸甘油(PM 1 B7)、L-鼠李糖(PM 1 C6)、D-蜜二糖(PM 1 C11)、D-天門冬胺酸(PM 1 D2)、尿苷(PM 1 D12)、M-酒石酸(PM 1 E2)、2-脫氧腺苷(PM 1 E11)、溴丁二酸(PM 1 F6)、甘氨酰-L-谷氨酸(PM 1 G1)、L-蘇氨酸(PM 1 G4)、甘氨酰-L-脯氨酸(PM 1 H1)、凝膠(PM 2 A7)、肝糖(PM 2 A8)、菊糖(PM 2 A9)、海帶多糖(PM 2 A10)、杏苷(PM 2 B4)、3-0-?-D半乳糖-D-吡喃糖(PM 2 B12)、龍膽二糖(PM 2 C1)、?-甲基-D-半乳糖苷(PM 2 C7)、α-甲基-D-甘露糖苷(PM 2 C10)、L-山梨糖(PM 2 D4)、水蘇糖(PM 2 D5)、γ-氨基丁酸(PM 2 D10)、奎尼酸(PM 2 F6)、L-精氨酸(PM 2 G4)、D,L-章魚胺(PM 2 H7)和2,3-丁二醇(PM 2 H10) （表1、2）。

除上述共有碳源外，地衣芽孢桿菌菌株6代謝的優勢碳源還包括：琥珀酸(PM 1 A5)、D-半乳糖(PM 1 A6)、L-天冬氨酸(PM 1 A7)、D-丙氨酸(PM 1 A9)、D-葡糖醛酸(PM 1 B5)、L-鼠李糖(PM 1 C6)、D-蜜二糖(PM 1 C11)、D-天門冬胺酸(PM 1 D2)、溴丁二酸(PM 1 F6)、丙酮酸甲酯(PM 1 G10)、凝膠(PM 2 A7)、肝糖(PM 2 A8)、菊糖(PM 2 A9)、杏苷(PM 2 B4)、龍膽二糖(PM 2 C1)、α-甲基-D-甘露糖苷(PM 2 C10)、γ-氨基丁酸(PM 2 D10)、奎尼酸(PM 2 F6)和L-精氨酸(PM 2 G4) （表1、2）。

除上述共有碳源外，解淀粉芽孢桿菌菌株3代謝的優勢碳源還包括：琥珀酸(PM 1 A5)、D-半乳糖(PM 1 A6)、L-天冬氨酸(PM 1 A7)、D-丙氨酸(PM 1 A9)、α-D-乳糖(PM 1 D9)、尿苷(PM 1 D12)、乙酰乙酸(PM 1 G7)、半乳糖醛酸(PM 1 H10)、肝糖(PM 2 A8)、杏苷(PM 2 B4)、3-0-?-D-半乳糖-D-吡喃糖(PM 2 B12)、龍膽二糖(PM 2 C1)（表1、2）。

同為飼料類芽孢桿菌，菌株5代謝的碳源數量略多于菌株4，除上述共有碳源外，飼料類芽孢桿菌菌株4代謝的優勢碳源還包括：L-天冬氨酸(PM 1 A7)、杏苷(PM 2 B4)、龍膽二糖(PM 2 C1)和精氨酸(PM 2 G4)；菌株5代謝的優勢碳源還包括：3-0-?-D半乳糖-D-吡喃糖(PM 2 B12)和龍膽二糖(PM 2 C1) （表1、2）。

同為枯草芽孢桿菌，菌株1代謝的碳源數量多于菌株2，除上述共有碳源外，菌株1代謝的優勢碳源還包括：D-半乳糖(PM 1 A6)、L-天冬氨酸(PM 1 A7)、D-丙氨酸(PM 1 A9)、α-D-乳糖(PM 1 D9)、尿苷(PM 1 D12)、3-0-?-D半乳糖-D-吡喃糖(PM 2 B12)和龍膽二糖(PM 2 C1)；菌株2代謝的優勢碳源還包括：D-糖二酸(PM 1 A4)、丙酮酸甲酯(PM 1 G10)和D-半乳糖醛酸(PM 1 H10)（表1、2）。

表1 7株芽孢桿菌在Biolog PM 1板上的碳源代謝特征

注：“?”、“+”及“++”分別表示Biolog PM 1板中的碳源能夠被各芽孢桿菌不代謝、代謝及高效代謝。A1-H12 代表Biolog PM 1微孔板被測試的碳源。

Note: “?”, “+” and “++” means that the tested bacteria could not utilize the tested carbon substrate, utilized moderately and effectively, respectively. A1 to H12 means the carbon substrates tested in Biolog PM 1 microplate.

表2 7株芽孢桿菌在Biolog PM 2板上的碳源代謝特征

注：“?”、“+”、及“++”分別表示Biolog PM 2板中的碳源能夠被各芽孢桿菌不代謝、代謝及高效代謝。A1?H12 代表Biolog PM 2微孔板被測試的碳源。

Note: “?”, “+” and “++” means that the tested bacteria could not utilize the tested carbon substrate, utilized moderately and effectively, respectively. A1 to H12 means the carbon substrates tested in Biolog PM 2 microplate.

3 討論與結論

目前，煙草病害防治登記的藥劑仍以化學藥劑為主，隨著綠色生態防控技術的發展與完善，生物農藥正被用于多種病害的防治?？莶菅挎邨U菌被登記用于防治煙草黑脛病、赤星病及野火病等，用于青枯病防治的菌株則有解淀粉芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌及熒光假單胞菌。盡管生防菌劑的防效有限，但隨著對產品安全性的重視，芽孢桿菌類的生防菌劑仍具有廣闊的前景。芽孢桿菌的研究涉及到各個領域，包括感受態、芽孢形成及其調控、遺傳操作、菌種改良、定殖規律、生物技術、基因組學、次生代謝產物等[22-25]。本研究通過微生物代謝表型分析測定了5種7株芽孢桿菌的190種碳源代謝表型，研究結果進一步豐富了芽孢桿菌的研究內涵。

碳源是微生物生長所需的一類營養物質，是含碳化合物，主要包括糖類、油脂、有機酸、有機酸酯和小分子醇。它為微生物的生長代謝提供細胞碳架，提供生命活動所需的能量，同時也提供其代謝產物的碳架[26-28]。碳源通常是制作微生物培養基或細胞培養基時必需的物質，為微生物或細胞的正常生長、分裂提供物質基礎。微生物由于產生酶系的不同，因而具有代謝不同碳源的能力。本研究中5種芽孢桿菌均能代謝的碳源為糖類和少量的有機酸；其中高效代謝的碳源以多糖為主，涉及糖酵解過程中的檸檬酸、延胡索酸、L-蘋果酸、丙酮酸等也能被高效代謝。研究結果表明糖類是芽孢桿菌賴以生存的基本物質，部分有機酸對其生命活動也具有重要的意義。長期以來，芽孢桿菌是生物農藥、生物肥料、生物飼料等微生物菌劑開發的重要資源；然而，諸多微生物菌劑的開發與應用仍存在技術障礙。本文獲得的芽孢桿菌高效代謝的特征性碳源對克服碳源營養障礙具有參考意義。

本文獲得了5種芽孢桿菌共有的碳源代謝特征，說明它們具有共同的酶系活性。此外，5種芽孢桿菌碳源代謝能力間存在顯著差異，短小芽孢桿菌代謝數量最多，其次為地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，飼料類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的數量相對較少。代謝數量的差異可能與種間的差異有關，短小芽孢桿菌在代謝有機酸類碳源上更具有優勢。這種差異是否與芽孢桿菌屬種間的遺傳距離有關還值得進一步深入研究。此外，同為飼料類芽孢桿菌（菌株4和5）和枯草芽孢桿菌（菌株1和2），菌株間的碳源代謝特征也不完全相同；但本文結果顯示種內間的差異較種間差異小。在后續研究中，有必要增加芽孢桿菌種類的數量和菌株的數量來獲得這類細菌更具有代表性的碳源代謝表型信息。

通過碳源代謝表型分析獲得了5種芽孢桿菌喜愛的碳源信息，同時也獲得了不利于其代謝的碳源信息。利用這些信息可以優化芽孢桿菌的培養條件、優化孢子形成或者萌發的條件、發現導致或抑制細胞分化的條件，以便最大程度地發揮這些細菌的功能和作用，使其應用于多種病害的生物防治、生物菌劑的開發，同時也可以為優化抗生素的工業化生產條件提供理論支持[29-30]。本文所獲得的芽孢桿菌碳源代謝表型信息是基于Biolog表型測定平臺。然而，這些細菌對相關底物的實際代謝和利用情況是否與表型測定結果一致、相關底物濃度和代謝能力間的關系、如何驗證相關底物對芽孢桿菌代謝的影響、相關底物對其孢子形成及次生代謝產物形成的影響、如何將相關底物用于生物菌劑的開發等諸多問題有待繼續開展研究。除此之外，芽孢桿菌菌種間的氮源、磷源、硫源等代謝表型特征，及其環境壓力下的代謝表型特征，也有待深入地進行比較分析。

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Phenotypic Characterization of Carbon Source Metabolism in Five BiocontrolSpecies

ZHANG Zhifan1, WANG Kaiyu1, MENG Yuan1, LIU Mingjing1, WANG Hancheng2*

(1. Zheng?an Filiale of Zunyi Tobacco Company, Zheng?an, Guizhou 563400, China; 2. Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China)

In order to understand carbon source metabolism of the biocontrol bacteria agent, seven strains in five species of(,,,and) were chosen for Biolog metabolic phenotypic analysis. The results indicated that the highest number of carbon metabolized by bacteria was found in, which had 107 different carbon sources; followed by(96 carbon sources),(89 carbon sources),(75 carbon sources for isolate 4 and 78 for isolate 5, respectively), and(74 carbon sources for isolate 1 and 70 for isolate 2, respectively). The metabolic phenotypic characteristics ofamong the strains and the species were different. There were 54 common carbon sources metabolized by all the tested bacteria, among which twenty four were effectively metabolized, including 17 polysaccharose (such as L-arabinose, D-trehalose, D-mannitol, glycerol, D-xylose, D-ribose, D-fructose, D-glucose, sucrose, etc.) and 7 organic acids (D,L-malic acid, L-asparagine, citric acid, fumaric acid, L-malic acid, pyruvate and 5-ketone-D-glucose acid). These findings provide scientific evidence to further developas potential bio-control agents and their actual use in the future.

; carbon sources; metabolic phenotype

S435.72

1007-5119（2018）04-0064-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2018.04.009

貴州省科技廳優秀青年人才培養計劃{黔科合平臺人才[2017]5619}；中國煙草總公司貴州省公司科技項目“‘互聯網+煙草植?！难芯颗c應用”（2017-14）

張之礬（1988-），男，碩士研究生，從事煙草生產技術推廣工作。E-mail：307153855@qq.com。

，E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com

2018-04-03

2018-06-14