絲素蛋白/姜黃素藥膜的體外降解性能研究

何一鳴 趙澤宇 賀超恒 謝旭升 樊珊佩 陳國強 李翼 李剛

摘要： 為了有效緩解結直腸癌引起的梗阻，文章在前期研制的覆膜生物可降解支架的基礎上，對支架外層藥膜的降解性能進行了研究。通過對三種不同藥物濃度的藥膜體外降解后的質量損失、降解液pH值變化、力學性能、二級結構、表面形貌，以及藥膜的藥物緩釋性能進行分析，研究其降解情況和影響因素。結果表明，三組藥膜的降解速度相近，均在15d降解完成，藥膜變成碎片狀，質量損失達60%，藥膜的silk I構型受到破壞。藥膜中的藥物釋放率高，可達（83.29±2.45）%。因此，該載藥支架藥膜在置入人體后可能在規定時間內完成降解并進行藥物釋放。

關鍵詞： 腸道支架;絲素蛋白;姜黃素;藥膜;體外降解? ?中圖分類號： TS102.54;R318.08 ???文獻標志碼： A ??文章編號： 1001-7003（2018）11-0011-07 ??引用頁碼： 111103

In vitro degradation of silk fibroin/curcumin drug-loaded membranes

HE Yiming ?1a， 2 ， ZHAO Zeyu ?1a，b ， HE Chaoheng ?1a，b ，XIE Xusheng ?1a，b ， FAN Shanpei ?1a ， ?CHEN Guoqiang ?1a，b ， LI Yi 3， LI Gang ?1a，b

（1a.College of Textile and Clothing Engineering; 1b.National Engineering Laboratory for Modern Silk， Soochow University， Suzhou 215123， ?China;

2.School of Chemistry and Chemical Engineering， Nanjing University， Nanjing 210093， China;

3.School of Materials， ?The University of Manchester， Manchester M13 9PL， UK）

Abstract： To effectively relieve obstruction caused by colorectal cancer， the biodegradation property of drug membrane at the outer layer of the stent was studied based on biodegradable stent developed. The degradation and influencing factors were investigated through analyzing mass loss of drug membrane with three different concentrations after in vitro degradation， pH changes of degradation solution， mechanical properties， secondary structure， morphology， and drug sustained release property of drug membrane. The results showed that the three groups of drug membranes had the similar degradation performance generally. Degradation behaviors were observed within 15 days， and drug membrane became shredded membrane. The mass loss reached 60%， and silk I configuration was damaged. The membranes had high drug release rate， as high as （83.29±2.45） %. Therefore， such drug membrane can complete degradation and release the drug within the specified time after implantation in the human body.

Key words： intestinal tract stent; silk fibroin; curcumin; drug membrane; in vitro degradation

近年來，隨著環境惡化和飲食結構的改變，結直腸癌（colon and rectal cancers，CRC）呈現高發態勢，成為世界第三大高發病率和死亡率的癌癥，已經引起了世界范圍內的廣泛關注。腸梗阻是該類疾病的常見臨床癥狀，通常直接采用外科手術來恢復暢通，但是由于急診手術風險大、創傷大和死亡率高。臨床中，常采用支架置入等方法作為過渡手術以緩解癥狀，配合放化療進行進一步治療。該手段創傷小、風險低，可快速緩解腸道梗阻，但存在支架材料選用方面和生物力學問題，容易引起腸道穿孔和出血等并發癥;同時，化療藥物經人體新陳代謝和層層分離后，實際到達腫瘤部位的有效藥物濃度極低，治療效率低下 ?[1-3] 。為了解決上述問題，采用生物材料結合藥物緩釋技術是一種有效的治療思路。生物可降解材料來源廣泛，可人工合成，也可從天然動植物提成，同時具有良好的生物相容性和生物可降解性能，與人體親和度高，是良好的體內植入材料 ?[4] 。本課題前期研究過程中，研制了一種絲素蛋白載姜黃素藥膜的聚二氧六環酮（polydioxanone，PDO）生物可降解支架。該支架可以在有效緩解梗阻的同時對腫瘤部位產生針對性的治療效果，副作用小。本文采用PDO作為原材料制作支架，該材料無毒性，是一種理想的生物可降解合成材料 ?[5] 。實驗采用絲素蛋白成膜技術，進行藥物搭載。該材料有著良好的成膜性，同時具有較高的機械強度，良好的生物相容性、降解可控性 ?[6-9] 。通過控制絲素蛋白的二級結構，增加Silk II構型含量，以及控制分子間相互結合方式，即可實現有效控制其降解 ?[10-14] 。

本文實驗中所用藥物為姜黃素，其是從姜黃科植物提取出的一種天然抗腫瘤藥物，為多酚類化合物 ?[15] 。其具有良好的抗癌效果，毒副作用小，被廣泛采用為抗癌藥物。姜黃素中含有的二酚基使姜黃素具有抗氧化和抗腫瘤作用 ?[16] 。采用姜黃素溶于聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）后再與絲素蛋白水溶液混合的方法具有可行性，可以用于腫瘤治療，抑制腫瘤生長，減少瘤體數目，減輕癌細胞的危害。

為了研究絲素蛋白藥膜在人體內的降解情況，確定不同姜黃素含量的藥膜的降解方式和規律，本文設計了三組具有不同姜黃素濃度的絲素蛋白藥膜，將其浸沒在用磷酸二氫鉀和胰蛋白酶配置成的人工腸液中，對降解液的pH值變化進行監測，并表征其降解后的外觀形貌、拉伸性能、二級結構及微觀形貌，探討藥膜的降解情況，為將來進行體內降解實驗研究打下前期基礎。

1 實 驗

1.1 材料及儀器

桑蠶絲（嵊州市協和絲綢有限公司），胰蛋白酶（豬胰臟）（蘇州氬氪氙貿易有限公司），聚乙二醇（相對分子質量400，優級純）（國藥集團化學試劑有限公司），姜黃素（Sigma）（美國西格瑪奧德里奇公司），其他所用試劑均為分析純。日立S4800型冷場發射掃描電子顯微鏡（SEM）（日本Hitachi公司），Thermo Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀（美國尼高力儀器公司），INSTRON5967萬能材料試驗機（美國英斯特朗公司）。

1.2 方 法

1.2.1 絲素蛋白溶液制備

制備絲素蛋白水溶液的第一步是進行絲素的脫膠。首先量取12L純水置于脫膠鍋中加熱;再稱取25.44g無水碳酸鈉及30g蠶絲;在純水沸騰之際加入無水碳酸鈉，使其充分溶解，并繼續加熱;待水溶液沸騰后將稱取好的蠶絲加入溶液中，每隔10min攪拌一次;煮30min后取出蠶絲，并在純水中反復搓洗3～4次，隨后置于通風櫥中過夜干燥。

將脫膠完全的絲素晾干后溶于摩爾濃度為 10mol/L 的溴化鋰溶液中。隨后稱取5份均為5g的蠶絲，分別裝在50mL燒杯中，并在每個燒杯中加入20mL摩爾濃度為10mol/L的溴化鋰溶液。玻璃棒攪拌使蠶絲充分浸入溶液中，再用錫箔紙包裹燒杯置于60℃的恒溫箱中加熱4h（每隔1h搖晃一次），使其溶解完全。待溶解完全后裝入透析袋透析36h，去除可溶性雜質（每隔4h換一次水）。在透析完成后取出溶液，隨后置于離心機上，在轉速為9000r/min，溫度3℃，轉動慣量（JA值）為25.5的條件下進行離心運動20min，去除不容雜質。離心完成后將絲素溶液裝于透析袋中置于2L的PEG-400溶液中進行濃縮、透析36h，隨后將絲素溶液濃度配置為15%。

1.2.2 絲素蛋白/姜黃素膜制備

室溫下對桑蠶絲進行溶絲、透析、離心及濃縮處理，得到質量分數為15%的絲素蛋白溶液。先將姜黃素溶解于聚乙二醇（PEG-400）中，即每毫升PEG-400加入5mg姜黃素。再將含姜黃素的聚乙二醇溶液與絲素蛋白溶液按照質量比1︰3、1︰6和1︰9均勻混合，混合溶液中姜黃素的質量分數分別為0125%、0.071%和0.056%，隨后在80℃的條件下烘干成膜。將制好的藥膜根據力學性能檢測要求制成10mm×30mm的矩形樣，每個樣品厚度均為 0.1mm。

1.2.3 絲素蛋白藥膜體外降解

實驗組設計如表1所示，分為加酶實驗組和不加酶實驗組兩組。

加酶實驗組：取磷酸二氫鉀6.8g，加水500mL使其溶解，用0.1mol/LNaOH溶液調節pH值至6.8。

取胰酶10g，加水適量使其溶解，將兩溶液混合后加水稀釋至1000mL。

不加酶實驗組：取磷酸二氫鉀6.8g，加水 500mL 使其溶解，用0.1mol/LNaOH溶液調節pH值至68，再加水稀釋至1000mL。

將樣品放在培養皿中進行降解，在加入降解液之前，先對樣品及培養皿進行稱量。再將降解液加入制好的樣品中，使溶液完全浸沒樣品。隨后放在37℃恒溫箱中，降解15d，每天更換降解液，保證酶的活性。分別在降解第3、6、9、12、15天取樣，并將取好的樣置于通風櫥過夜干燥。

1.2.4 力學性能檢測

將準備好的樣品用人工腸液浸潤，隨后在溫度為25℃、相對濕度為65%的條件下，調整拉伸速度為20mm/min，兩夾頭間距為20mm進行拉伸實驗。記錄其斷裂強力F和斷裂伸長率。藥膜的斷裂強度用下式計算得出。

BS=F/A（1）

A=D×W（2）

式中：BS為藥膜斷裂強度，cN/mm 2;F為藥膜斷裂強力，cN;A為藥膜橫截面面積，mm 2;D為藥膜的厚度，mm;W為藥膜的寬度，mm。

1.2.5 pH值變化

在更換降解液時，1mL針頭注射器吸走上清液，用校正過的電子pH檢測儀檢測pH值。首先用去離子水將檢測電極沖洗干凈，隨后將電極放在燒杯中，使其浸沒在溶液里。待檢測儀屏幕顯示穩定后記錄數據。

1.2.6 質量損失

每個取樣點處稱量藥膜加培養皿的質量，每種樣品設置四個平行樣，將樣品放置在空培養皿中，進行稱重記錄為W 1。定期取樣，用1mL針頭注射器吸走上清，以避免降解后的一些細小碎片丟失，用超純水沖洗抗菌涂層材料，并用1mL針頭注射器吸走，置于60℃烘箱烘干2h。隨后將降解后的抗菌涂層材料和培養皿一起稱重記為W 2?？咕繉硬牧系馁|量損失率用下式計算得出。

W L/%=W 1-W 2W 1×100（3）

式中：W L是藥膜質量損失率;W 1是藥膜降解前質量;W 2是藥膜降解后質量。

1.2.7 膜形貌表征

隨機選取外層藥膜樣品，并對其進行噴金處理 90s， 在冷場發射掃描電子顯微鏡下觀察藥膜表面 形態。

1.2.8 二級結構表征

從每個組分隨機取出一個樣本，剪成粉末狀;取2mg樣品和20mg的溴化鋰，在瑪瑙研缽中研磨，放入模具，壓成薄片;對制成的樣品進行光譜測試，范圍為400～4000cm ?-1 。將藥膜降解前后的光譜圖進行對比，分析降解中藥膜二級結構變化情況。

1.2.9 藥物緩釋性能

緩釋液的配方如表2所示，將藥品溶于800mL的去離子水中，并調節pH值至7.4，隨后定容至1L以配置0.1mol/L的PBS緩沖液。第二步取92mL PBS緩沖液，加入5mL的10%吐溫和3mL甲醇，配置成緩釋液。

分別稱取三種質量分數不同的藥膜0.1g，計算出其姜黃素含量。對制好的樣品進行水蒸氣處理 6h， 使其不溶于配置好的緩釋溶液。隨后將藥膜置于5mL離心管內，加入2mL磷酸鹽緩沖溶液，密封后置于恒溫搖床37℃，100r/min。一定時間間隔吸取0.5mL待測液，測定姜黃素（波長為425nm）的累積釋放率，同時滴加0.5mL新鮮磷酸鹽緩沖溶液。

2 結果及分析

2.1 拉伸性能

由于絲素蛋白的水溶性，絲素蛋白基藥膜在浸泡第3天就出現破裂現象，已不滿足拉伸性能檢測的相關要求，因此，此處只對未降解的藥膜進行力學性能檢測。圖1為三種不同藥物質量分數的絲素蛋白藥膜的力學性能。質量分數分別為0.125%、0071%和0.056%的三組藥膜的斷裂強力依次為907.26cN/mm 2、996.65cN/mm 2和1173.10cN/mm 2，斷裂伸長率依次為16.85%、18.21%和19.58%。從

圖1可以看出，隨著姜黃素濃度的降低，藥膜的斷裂強度有所提高，但是總體較為接近。說明姜黃素的加入在一定程度上降低了藥膜的拉伸強度。

2.2 pH值變化

根據文獻顯示，絲素蛋白的降解產物中的游離氨基酸主要為天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、異亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe） ?[20-23] ，這些氨基酸的等電點處于5.0～6.5，在溶液中顯酸性。降解過程中兩組降解液的pH值變化情況如圖2所示。

圖2（a）是加酶降解組的pH值變化曲線，加入的降解液pH值為6.8。由該圖可知從降解第3天開始，質量分數為0.125%藥膜的降解液的pH值率先降低到5.78，其后降解液的pH值下降加快，并于降解第10天達到最低值。在此處質量分數分別為0125%、0.071%和0.056%的三組藥膜的pH值依次為4.17、4.79和4.52，隨后降解液的pH值逐漸增加，在第13天達到7.0后保持穩定。說明在前三天胰蛋白酶首先在藥膜的表面發揮作用，但沒有破壞絲素蛋白內部結構。而第3天以后絲素蛋白內部結構開始受到破壞，產生游離的氨基酸，同時破壞速度在逐漸加快，直到第10天達到最高。隨著無定形區域完全遭到破壞，溶液pH值降低并趨于穩定。而在圖2（b）中降解液的pH值一直保持穩定，在7.0上下浮動。說明沒有胰蛋白酶存在的緩沖液，會減緩藥膜的降解速度。

2.3 質量損失

降解過程中的樣品質量殘余率如圖3所示。從圖3（a）可以看出，在降解的第3天藥物質量分數分別為0.125%、0.071%和0.056%的藥膜的質量損失不高，剩余百分比分別為87%、81%和83%。這是因為絲素蛋白膜具有一定的水溶性，有一部分絲素蛋白溶解在水中。在第3天之后，藥膜的質量明顯降低，直至第9天質量剩余率為56%、51%和50%，隨后質量降低減緩，并在12d后趨于平緩。在第15天三組藥膜的質量分別剩余42%、41%和38%，此時降解完成。該結果和前文對pH值的分析一致，降解從第3天開始加速至第10天后減緩，最后趨于平穩。同時圖3（a）可看出，藥物的加入提高了藥膜的降解程度。

從圖3（b）可以看出，在不加酶的緩沖液中三組藥膜的質量也有明顯下降，質量剩余率分別為56%、50%和53%，說明該藥膜的水溶性較強，宜干燥保存。

2.4 掃描電鏡

不同降解條件的藥膜表面形貌如圖4所示。隨著姜黃素質量分數的提高，藥膜的結晶度開始增加，從而使其表面更加平整。從圖4（a～c）可以看出，在降解前藥膜表面光滑平整，說明其結構保持穩定。在圖4（d～f）中可看到，加酶降解組藥膜在第12天其表面出現了明顯的裂縫，表面結構受到破壞，變得不再均勻。而降解到第15天的藥膜表面則有更多較為明顯的裂縫，表面結構受到嚴重破壞。圖4（j～l）的未加酶的藥膜，在降解第15天時表面仍保持著較完整的結構，沒有明顯的破壞痕跡。說明藥膜在加酶溶液中降解比較完全，表面結構受到了嚴重破壞。但是在未加酶的對照組中，雖然藥膜有一定水溶性，但是其表面結構沒有受到明顯破壞。

2.5 紅外光譜分析

根據文獻研究，酰胺I（1600～1700cm ?-1 ）里β折疊的最大吸收峰位于1616～1637cm ?-1 ，無規卷曲的最大吸收峰出現在1638～1655cm ?-1 ，α螺旋的最大吸收峰在1656～1662cm ?-1 ，β轉角的最大吸收峰在 1663～ 1696cm ?-1[17-19] 。且峰值位于1616～1637cm ?-1 及1697～1703cm ?-1 為silk II 構型 ?[19] 。純絲素蛋 白膜 和不同參數藥膜的傅里葉變換紅外光譜如圖5所示。由圖5可知，在降解前絲素藥膜同時包含 silk I 和silk II兩種結構，隨著降解的進行峰值發生了減弱和偏移。從降解第9天開始，1518cm ?-1 和 1627cm ?-1? 處的峰值出現了明顯減弱，在1702cm ?-1 處的峰值偏移到1720cm ?-1 處。對比降解產物中，silk I的峰值幾乎消失，僅剩silk II峰值，說明此階段的降解完全破壞了藥膜的無定型區域，但是對具有silk II構型的結晶區破壞不明顯。

2.6 藥物緩釋性能

三組不同質量分數的姜黃素藥膜釋放曲線如圖6所示。三組不同質量分數的藥膜在400h內持續釋放藥物并于400h時達到最高釋放率。其中，質量分數為0.125%的姜黃素藥膜的累積釋放率最高，達（83.29±2.45）%。從圖6

可以看出，隨著姜黃素藥膜質量分數的提高姜黃素的累積釋放速率逐漸增大，同時累積釋放率也得到了明顯的提高。相較于質量分數為0.125%的藥膜，另外兩組藥膜的藥物累積釋放率則有所降低，分別為（78.15±3.92）%和（68.20±7.26）%。說明質量分數為0.125%的姜黃素藥膜有著最佳的藥物緩釋性能，能夠保證藥物的充分利用。分析認為，該質量分數的姜黃素藥物與絲素蛋白均勻混合，并隨著絲素蛋白的降解而實現緩慢地釋放藥物。

3 結 論

本文討論了絲素蛋白搭載姜黃素藥膜的體外降解性能。制備了三種不同載藥含量的藥膜，并對它們在降解過程中降解液的pH值變化、藥膜質量變化、表面形貌、二級結構，以及藥膜的藥物緩釋性能進行了表征分析。研究結果表明：隨著姜黃素濃度的降低，藥膜的斷裂強度有所提高，但是總體較為接近。說明姜黃素的加入在一定程度上降低了藥膜的拉伸強度。降解液的pH值變化的總體趨勢為先下降后上升，在第10天的時候達到最大值。藥膜質量的損失顯示出藥物的加入降低了藥膜的降解程度且藥膜的水溶性較強，宜干燥保存。經過加酶降解的藥膜降解速度明顯快于不加酶組。降解中胰蛋白酶優先破壞具有silk I結構的無定形區，對具silk II結構的結晶區破壞不明顯。藥物緩釋結果證明了藥膜的藥物釋放效率較好，能夠在規定時間內完成藥物釋放任務。因此，該載藥支架藥膜在置入人體后可能在規定時間內完成降解和進行藥物釋放，在結直腸癌的治療中有一定的研究和應用價值。

參考文獻：

[1]LI Gang， LI Yi， LAN Ping， et al. Biodegradable weft-knitted intestinal stents： fabrication and physical changes investigation in vitro degradation [J]. Journal of Biomedical Materials Research： Part A， 2014，102（4）： 982-990.

[2]WEITZ J， KOCH M， DEBUS J， et al. Colorectal cancer ： the Lancet [J]. Lancet， 1999， 353： 1012.

[3]謝旭升， 李剛， 李翼， 等. 生物醫用紡織腸道支架研究進展[J]. 產業用紡織品， 2016， 34（10）： 1-10.

XIE Xusheng， LI Gang， LI Yi， et al. Advances in biomedical textile intestinal stents for treatment of colorectal cancer [J]. Technical Textiles， 2016，34（10）： 1-10.

[4]劉國華. 編織結構生物可降解神經再生導管的制造及性能研究[D]. 上海： 東華大學， 2006.

LIU Guohua. Fabrication and Properties of Braided Biodegradable Nerve Regeneration Conduits [D]. Shanghai： Donghua University， 2006.

[5]段巧艷， 段祥， 張煥相. 絲素蛋白在組織工程中的應用[J]. 中國組織工程研究與臨床康復， 2007， 11（26）： 5199-5203.

DUAN Qiaoyan， DUAN Xiang， ZHANG Huanxiang. Silk fibroin in tissue engineering[J]. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research， 2007， 11（26）： 5199-5203.

[6]SHANG K， RNJAK-KOVACINA J， LIN Y， et al. Accelerated in vitro degradation of optically clear low β-sheet silk films by enzyme-mediated pretreatment [J]. Translational Vision Science & Technology， 2013， 2（3）： 2.

[7]KUNDU ?B， RAJKHOWA R， KUNDU S C， et al. Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations [J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2013， 65（4）： 457-470.

[8]YOU R， ZHANG Y， LIU Y， et al. The degradation behavior of silk fibroin derived from different ionic liquid solvents [J]. Natural Science， 2013， 5（6）： 10-19.

[9]WANG ?Y， RUDYM D D， WALSH A， et al. In vivo， degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds [J]. Biomaterials， 2008， 29（24）： 3415-3428.

[10]MAKAYA ?K， TERADA S， OHGO K， et al. Comparative study of silk fibroin porous scaffolds derived from salt/water and sucrose/hexafluoroisopropanol in cartilage formation [J]. Journal of Bioscience & Bioengineering， 2009， 108（1）： 68-75.

[11]NUMATA ?K， CEBE P， KAPLAN D L. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals [J]. Biomaterials， 2010， 31（10）： 2926-2933.

[12]HU Y， ZHANG Q， YOU R， et al. The relationship between secondary structure and biodegradation behavior of silk fibroin scaffolds [J]. Advances in Materials Science & Engineering， 2013， 2012（6）： 15-25.

[13]KOJTHUNG A， MEESILPA P， SUDATIS B， et al. Effects of gamma radiation on biodegradation of Bombyx mori silk fibroin [J]. International Biodeterioration & Biodegradation， 2008， 62（4）： 487-490.

[14]ZHAO C， WU X， ZHANG Q， et al. Enzymatic degradation of Antheraea pernyi silk fibroin 3D scaffolds and fibes [J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2011， 48（2）： 249-255.

[15]汪叢叢， 莊靜， 馮福彬， 等. 姜黃素抑制肺癌細胞血管擬態形成機制探討[J]. 中華腫瘤防治雜志， 2015， 22（4）： 243-246.

WANG Congcong， ZHUANG Jing， FENG Fubin， et al. Regulative research of curcumin mediated angiogenesis mimicry of lung cancer cell by wnt/β-catenin signaling pathway [J]. Chinese Journal of Cancer Prevention and Treatment， 2015， 22（4）： 243-246.

[16]郭立達， 焦振霞， 宋瑛， 等. 姜黃素誘導結腸癌LoVo細胞凋亡的作用及機制研究[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（13）： 2191.

GUO Lida， JIAO Zhenxia， SONG Ying， et al. Study on functions and mechanism of curcumin in inducing colorectal carcinoma cells LoVo apoptosis [J]. China Journal of Chinese Materia Medica， 2013， 38（13）： 2191.

[17]張琴， 扈永培， 焦宇虹， 等. 絲素蛋白材料的結構與生物降解行為的關系[C]//全國青年材料科學技術研討會論文集. 2011.

ZHANG Qin， HU Yongpei， JIAO Yuhong， et al. Relationship between structure and biodegradation behavior of silk fibroin materials [C]// National Youth Materials Science and Technology Seminar. 2011.

[18]吳修芳. 柞蠶絲素蛋白的體外酶降解研究[J].國外絲綢， 2008， 23（5）： 8-10.

WU Xiufang. Study on enzymatic degradation of tussah silk fibroin protein in vitro [J].Silk Textile Technology Overseas， 2008， 23（5）： 8-10.

[19]陳杰. 天然絲素蛋白的酶水解研究[D]. 蘇州： 蘇州大學， 2001.

CHEN Jie. Study on Enzymatic Hydrolysis of Natural Silk Fibroin [D]. Suzhou： Soochow University， 2001.

[20]YOU R， XU Y， LIU Y， et al. Comparison of the in vitro and in vivo degradations of silk fibroin scaffolds from mulberry and nonmulberry silkworms [J]. Biomedical Materials， 2015， 10（1）： 15003.

[21]LEFEVRE T， RPUSSEAU ME， PEZOLET M. Protein secondary structure and orientation in silk as revealed by Raman spectromicroscopy [J]. Biophysical Journal， 2007，92（8）： 2885-2895.

[22]CEBE P， PARTLOW B P， KAPLAN D L， et al. Silk I and Silk II studied by fast scanning calorimetry [J]. Acta Biomaterialia， 2017， 55： 323-332.

[23]HINO T， TANIMOTO M， SHIMABAYASHI S. Change in secondary structure of silk fibroin during preparation of its microspheres by spray-drying and exposure to humid atmosphere [J]. Journal of Colloid & Interface Science， 2003， 266（1）： 68-73.