不同紫花苜蓿品種在均勻與不均勻 鹽脅迫下的耐鹽性評價

熊雪，桂維陽，劉沫含，陳繼輝，張英俊,3,4*

(1.南京農業大學草業學院，江蘇 南京 210095；2.河北民族師范學院，河北 承德 067000；3.中國農業大學 動物科技學院，北京 100193；4.農業部草地管理與合理利用重點實驗室，北京 100193)

土壤鹽分已經成為限制全球農業生產力的主要環境因素之一[1-2]。在全球的干旱和半干旱地區，約有50%的灌溉土地受到鹽堿化的影響，區域內的非灌溉土地同樣也會發生鹽堿化[3]。在自然界中，由于降雨、灌溉、土壤淋溶、蒸發等多種因素的相互作用，導致土壤中的鹽分分布存在空間和時間上的異質性[4-6]，同一株植物的根系可能會處于不同的鹽分濃度下[7]。目前關于植物品種耐鹽性的研究都是在均勻的鹽脅迫條件下進行的，而對于不均勻鹽脅迫下品種耐鹽性的比較研究未見報道。研究不均勻鹽脅迫下不同品種的耐鹽性是對植物耐鹽性研究的一個重要補充，也為耐鹽性品種的選育提供重要的參考依據。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為全球廣泛種植的栽培牧草，素有“牧草之王”的美稱[8]，具有相對較強的耐鹽性和改良土壤鹽堿性的作用[9-10]。但不同的紫花苜蓿品種耐鹽性相差較大，且不同鹽堿條件下的同一品種耐鹽性也存在差異[11-14]。在鹽脅迫下各種耐鹽機制在不同的品種中分別被激活，并產生相應的抗性反應。所以綜合考慮鹽脅迫下植物的光合作用效率、水分吸收、膜質過氧化程度等生理指標，可以作為品種耐鹽性評估的重要參考依據[2]。本試驗選取6個紫花苜蓿品種作為研究對象，分別在均勻鹽脅迫和不均勻鹽脅迫下測定其植株生長速率、地上生物量、地下生物量、水分吸收、電導率、丙二醛、葉綠素等指標，并通過隸屬函數法對不同鹽分處理下紫花苜蓿品種的耐鹽性進行綜合評價，以期為紫花苜蓿耐鹽性評價及新品種選育提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用6個紫花苜蓿品種分別為：中苜一號、阿爾岡金、WL353LH、WL298HQ、WL343HQ和WL354HQ，中苜一號由中國農業科學院畜牧研究所提供，其余品種購自北京正道生態科技有限公司。

1.2 材料培養與脅迫處理

選取均勻一致的紫花苜蓿種子用70%的乙醇清洗30 s，再用5%的次氯酸鈉消毒15 min，后用蒸餾水反復沖洗4～5次，將整齊的種子播種于滅菌的濕砂中。7 d后待紫花苜蓿全部出苗，主根長度為3～5 cm時，選取整齊一致的幼苗，剪去根尖(5 mm)以促進其側根生長，便于后面的分根試驗。然后將幼苗置于營養液中進行水培(營養液濃度逐漸增大，至第10天為全濃度營養液)。每隔一天更換一次營養液，進一步培養4 d后取長勢良好的幼苗移到分根裝置中。營養液組成及濃度為：2.5 mmol·L-1Ca(NO3)2、2.5 mmol·L-1KNO3、1 mmol·L-1MgSO4、0.5 mmol·L-1NH4H2PO4、0.1 mmol·L-1EDTA-FeNa、0.2 μmol·L-1CuSO4、1 μmol·L-1ZnSO4、20 μmol·L-1H3BO3、0.005 μmol·L-1(NH4)6Mo27O4和1 μmol·L-1MnSO4。分根裝置由兩個0.35 L的塑料杯和一塊中間帶有圓孔的泡沫板組成，植物根系穿過圓孔固定于泡沫板上，將植物的根系分為均勻的兩部分分別置于兩個塑料杯中，以便使植物根系同時處于不同的鹽分濃度處理下。

分根裝置中培養5 d后，對各植物幼苗進行不同的鹽濃度處理。試驗共分為4個處理，包括對照0/0 mmol·L-1NaCl處理，不均勻鹽脅迫0/200 mmol·L-1NaCl處理以及均勻鹽脅迫100/100、200/200 mmol·L-1NaCl處理(“/”兩邊代表左右兩端根系)，每個處理8個重復。為避免鹽分振蕩，所有幼苗的鹽分濃度均每隔24 h逐漸增加，直到4 d后達到最終濃度。試驗于2017年6-8月在人工氣候室中進行，光/暗周期為14 h/10 h，溫度為白天25 ℃/夜晚20 ℃，空氣相對濕度為白天55%/夜晚90%。

1.3 測定指標

1.3.1植物生長指標的測定 植物最終脅迫15 d后進行取樣，分別取植物地上部分、左右兩側根系于105 ℃殺青30 min，在65 ℃烘箱中烘干48 h至恒重，分別測定其地上部分及兩側根系的干重。測量脅迫前及脅迫15 d后紫花苜蓿的主莖高度計算其生長速率，每個處理6次重復。

1.3.2水分吸收的測定 所有分根裝置中的營養液體積均為350 mL，每次更換營養液及脅迫15 d后用量筒測量裝置中的剩余營養液體積，并設置無植物培養的裝置計算營養液蒸發量，最終計算得出植物水分吸收量，每個處理7次重復。

1.3.3生理指標的測定 采用Arnond[15]的丙酮提取法測定葉綠素(chlorophyll, Chl)含量；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量[16]；采用酸性茚三酮比色法測定脯氨酸(proline, Pro)含量[17]。采用電導率法測定細胞膜透性[16]。每個處理3次重復。

1.4 數據分析

采用SPSS 19.0對各指標的測定值進行方差分析。試驗中采用相對值進行品種間的耐鹽性比較，即各指標的測定值與對照的比值。利用隸屬函數法[18]對各指標的相對值進行綜合評價并對其耐鹽性進行排序。

隸屬函數分析方法如下：

Yij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(1)

Yij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(2)

式中：Yij為i品種j指標的隸屬函數值；Xij為i品種j指標的均值；Xjmax為各品種j指標均值的最大值；Xjmin為各品種j指標均值的最小值。若j指標與抗鹽性呈正相關，用公式(1)；若j指標與抗鹽性呈負相關，用公式(2)。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿生長速率的變化

鹽脅迫下，植株生長受到抑制。紫花苜蓿的植株生長速率不論在哪種鹽脅迫處理下均呈下降趨勢。不同品種同一濃度鹽脅迫下植株生長速率表現不同，同一品種低鹽脅迫和不均勻鹽脅迫下與高鹽脅迫下的植株生長速率表現也不同(表1)。用植株生長速率的相對值反映植物耐鹽性的高低，植株的相對生長速率值越大則該品種越耐鹽，相對生長速率值越小則越不耐鹽。在3種濃度處理下中苜一號的相對生長速率均最高，表現出較強的耐鹽性。在濃度為100/100和0/200 mmol·L-1NaCl處理下，WL353LH相對生長速率值最低，200/200 mmol·L-1NaCl處理下WL298HQ相對生長速率值最低，表現出較弱的耐鹽性(表1)。

2.2 紫花苜蓿生物量的變化

鹽脅迫下，植物地上生物量均呈下降趨勢，鹽脅迫對紫花苜蓿地上部分生物量的影響要大于對根系的影響。在濃度為100/100 mmol·L-1NaCl 處理下，品種WL353LH、WL298HQ和WL354HQ的地上生物量顯著低于對照(P<0.05)，而中苜一號、阿爾岡金和WL343HQ的地上生物量與對照無顯著差異。當濃度達到200/200 mmol·L-1NaCl 時各品種的地上生物量均顯著降低(P<0.05)，其中對中苜一號的地上生物量影響最小，對WL298HQ的地上生物量影響最大。而在不均勻鹽脅迫(0/200 mmol·L-1NaCl)下，中苜一號和WL354HQ的地上生物量與對照相比差異不顯著，不均勻鹽脅迫對阿爾岡金的地上生物量影響最大，表現出較低的耐鹽性(表2)。

表1 不同鹽脅迫下6個紫花苜蓿品種生長速率Table 1 The plant growth rates of six alfalfa varieties under different salt stress

注：同行不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: The different lowercase letters in the same line indicate significant differences between salt treatments(P<0.05). The same below.

相比地上部分，鹽脅迫對地下生物量的影響較小。當鹽脅迫濃度為100/100 mmol·L-1NaCl處理時，只有阿爾岡金和WL298HQ的地下生物量顯著低于對照(P<0.05)。當鹽濃度增加到200/200 mmol·L-1NaCl時，阿爾岡金、WL353LH、WL298HQ的地下生物量顯著低于對照(P<0.05)。當紫花苜蓿各品種處于不均勻鹽脅迫(0/200 mmol·L-1NaCl)處理時，只有阿爾岡金的地下生物量顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 不同鹽脅迫下6個紫花苜蓿品種地上生物量和地下生物量Table 2 The aboveground biomass and underground biomass of six alfalfa cultivars under different salt stress

2.3 紫花苜蓿水分吸收的變化

本研究中，6個紫花苜蓿品種的水分吸收在均勻和不均勻的鹽脅迫下均受到不同程度的抑制。在均勻的(100/100 mmol·L-1NaCl)處理下，除中苜一號外，其余5個品種的水分吸收量都顯著降低(P<0.05)(表3)。根據其水分吸收的相對值變化可以得出，WL298HQ的水分吸收相對值最低，耐鹽性較弱。而在200/200 mmol·L-1NaCl處理下，WL343HQ的水分吸收下降最大，表現出較弱的耐鹽性。在不均勻鹽脅迫(0/200 mmol·L-1NaCl)處理下，中苜一號和WL354HQ的水分吸收量與對照差異不顯著，耐鹽性較強，阿爾岡金的水分吸收相對值最小，耐鹽性較弱(表3)。此外，在不均勻鹽脅迫下紫花苜蓿各品種83%～91%的水分吸收來自無鹽脅迫處理一端，且顯著高于0/0處理一端的水分吸收量。

表3 不同鹽脅迫下6個紫花苜蓿品種水分吸收Table 3 The water uptake of six alfalfa cultivars under different salt stress

2.4 紫花苜蓿細胞膜透性的變化

紫花苜蓿在均勻和不均勻的鹽脅迫下，細胞膜均受到一定程度的傷害。與對照相比，各品種在幾種鹽分濃度下電導率均顯著增加(P<0.05)，細胞膜透性增大(表4)。在鹽脅迫下，電導率的相對值增加越大，證明細胞膜受到的傷害越嚴重，植物的耐鹽性越差。相比之下，在100/100 mmol·L-1NaCl處理下，中苜一號和WL354HQ的耐鹽性稍強，WL298HQ和WL353LH的耐鹽性較弱。當鹽分濃度達到200/200 mmol·L-1NaCl時，WL354HQ和WL343HQ的耐鹽性稍強，阿爾岡金的耐鹽性較弱。而在不均勻鹽脅迫(0/200 mmol·L-1NaCl)處理下，中苜一號和WL354HQ的耐鹽性稍強，阿爾岡金和WL353LH的耐鹽性較弱(表4)。

表4 不同鹽脅迫下6個紫花苜蓿品種細胞膜透性Table 4 The cell membrane permeability of six alfalfa cultivars under different salt stress

2.5 紫花苜蓿膜質過氧化的變化

MDA是細胞膜質過氧化的產物，可以反映植物受到逆境脅迫傷害的程度。在均勻和不均勻鹽脅迫下，6個紫花苜蓿品種的MDA含量均顯著增加(P<0.05)。其中中苜一號在3種鹽濃度處理下MDA含量的變化相對較小，表現出較強的耐鹽性。在均勻鹽脅迫(100/100和200/200 mmol·L-1NaCl)處理下，WL298HQ的MDA含量增加相對較大，耐鹽性較差。而在不均勻鹽脅迫(0/200 mmol·L-1NaCl)處理下，阿爾岡金的細胞膜質過氧化程度最大，表現出較低的耐鹽性(表5)。

2.6 紫花苜蓿葉綠素含量的變化

鹽脅迫下植物的光合作用受到抑制，葉綠素含量隨著鹽脅迫濃度的增加而降低。在均勻鹽脅迫(100/100 mmol·L-1NaCl)處理下，與對照相比，中苜一號和WL353LH的葉綠素含量變化不顯著，其余品種葉綠素含量均顯著降低(P<0.05)。中苜一號和WL353LH的葉綠素含量相對值較高，表現出較強的耐鹽性，WL343HQ的耐鹽性相對較弱。當鹽脅迫濃度增加為200/200 mmol·L-1NaCl時，6個紫花苜蓿品種的葉綠素含量均顯著降低(P<0.05)。其中阿爾岡金的葉綠素含量下降最大，說明其在該濃度下光合作用受到嚴重抑制，耐鹽性較弱。在不均勻鹽脅迫(0/200 mmol·L-1NaCl)處理下，WL298HQ的耐鹽性相對較強，阿爾岡金的耐鹽性較弱(表6)。

表5 不同鹽脅迫下6個紫花苜蓿品種丙二醛含量Table 5 The MDA contents of six alfalfa cultivars under different salt stress

表6 不同鹽脅迫下6個紫花苜蓿品種葉綠素含量Table 6 The chlorophyll contents of six alfalfa cultivars under different salt stress

2.7 紫花苜蓿脯氨酸含量的變化

Pro作為滲透調節劑參與鹽脅迫下植物的滲透調節。但是目前關于Pro含量與植物耐鹽性的關系一直存在爭議[18-20]。本研究中鹽脅迫對6個紫花苜蓿品種的Pro含量影響均較大，在受到鹽脅迫后各品種均顯著增加(P<0.05)。但各品種的Pro含量與耐鹽性表現存在一定的不一致性，并不是Pro的含量越高，品種在鹽脅迫下的生長越好(表7)。所以不能明確Pro含量與植物抗鹽性的關系。

2.8 紫花苜蓿各品種耐鹽性綜合評價

因為Pro含量與植物耐鹽性的關系存在不一致性， 不計算其隸屬函數值。 本研究選取各鹽分濃度下植株生長速率、地上和地下生物量、水分吸收、電導率、MDA和葉綠素含量變化的相對值作為耐鹽性綜合評價的指標。經相關性分析得出各指標與植物耐鹽性的正負相關關系，各性狀的相關性均達到了顯著或極顯著水平(表8)。通過隸屬函數法分別計算均勻鹽脅迫(100/100、200/200 mmol·L-1NaCl)和不均勻鹽脅迫(0/200 mmol·L-1NaCl)下的隸屬度平均值，并進行排序。結果得出在100/100 mmol·L-1NaCl處理下，6個紫花苜蓿品種的耐鹽性為中苜一號>WL354HQ>WL343HQ >WL353LH>阿爾岡金>WL298HQ(表9)。0/200 mmol·L-1NaCl處理下耐鹽性為中苜一號>WL354HQ>WL298HQ>WL343HQ>WL353LH>阿爾岡金(表10)。200/200 mmol·L-1NaCl處理下耐鹽性為中苜一號>WL354HQ>WL343HQ>WL353LH>阿爾岡金>WL298HQ(表11)。

表7 不同鹽脅迫下6個紫花苜蓿品種脯氨酸含量Table 7 The proline contents of six alfalfa cultivars under different salt stress

表8 相對值相關性分析Table 8 Correlation analysis of relative values

注：*表示各相對值的顯著性關系：*P<0.05，**P<0.01，***P≤0.001。Chl: 相對葉綠素含量。

Note：Correlations are significant at *P<0.05, **P<0.01, ***P≤0.001. Chl: Relative chlorophyll contents.

表9 不同紫花苜蓿品種在100/100 mmol·L-1鹽脅迫下耐鹽性綜合評價Table 9 Comprehensive evaluation of salt tolerance of alfalfa varieties under 100/100 mmol·L-1 salt stress

表10 不同紫花苜蓿品種在0/200 mmol·L-1 鹽脅迫下耐鹽性綜合評價Table 10 Comprehensive evaluation of salt tolerance of alfalfa varieties under 0/200 mmol·L-1 salt stress

表11 不同紫花苜蓿品種在200/200 mmol·L-1 鹽脅迫下耐鹽性綜合評價Table 11 Comprehensive evaluation of salt tolerance of alfalfa varieties under 200/200 mmol·L-1 salt stress

3 討論

評價植物的耐鹽性通常包括直接測定和間接測定兩種方法。直接指標的測定包括植株生長速率、生物量、存活率等，本研究中紫花苜蓿在鹽脅迫(均勻、不均勻)處理下植株生長速率、生物量等均呈降低趨勢，這些指標的相對變化情況可以直接反映出植物對鹽脅迫的抗性強弱[21]。這也是其他品種比較試驗中常用的耐鹽性評價指標[11-13]。

間接測定一般利用一些生理生化指標作為耐鹽性的鑒定指標，如水分吸收、電導率、MDA、葉綠素、抗氧化物質等[22-23]。當鹽分存在于植物根際時會降低土壤滲透勢，導致植物吸水困難，形成生理干旱，進而抑制生長[24]。已有的研究發現，當植物處于不均勻的鹽脅迫下，低鹽或無鹽一端的補償吸水作用對于促進植物不均勻鹽脅迫下的生長具有重要作用[7,25]。因此將水分吸收情況作為評價植物耐鹽性，特別是在不均勻鹽脅迫下耐鹽性的重要指標。植物細胞膜對維持細胞的微環境和正常代謝起著重要作用。相對電導率可以反映植物細胞膜受到傷害的程度，相對電導率越大，細胞膜透性增強，說明植物細胞受到的傷害越大。而膜透性增大的程度也取決于植物抗逆性的強弱[26]。王運琦等[27]研究表明細胞質膜透性可以作為紫花苜蓿耐鹽性評價的指標之一。另外，MDA作為細胞膜質過氧化產物同樣可以反映植物細胞膜受傷害程度，作為植物耐鹽性強弱的指標之一[21,28]。葉綠素作為植物體內重要的光合物質反映植物光合作用的強弱，鹽脅迫會降低植物葉片中的葉綠素含量進而影響植物的生長發育[29-30]。在鹽脅迫下維持植物葉片較高的葉綠素含量可以增強耐鹽能力[31]。劉晶等[18]對兩個紫花苜蓿品種耐鹽性的比較研究也得出植物的MDA和葉綠素含量與鹽害的結果相對應。本研究中，紫花苜蓿各品種的水分吸收、電導率、MDA和葉綠素含量與耐鹽性存在顯著的相關性，可以作為耐鹽性的評價指標。Pro作為逆境脅迫下的滲透調節物質在鹽脅迫下研究得較多，但是關于Pro是否可以作為耐鹽性判定的指標存在不同的意見。王玉祥等[32]對苜蓿的研究發現，在鹽脅迫下Pro積累的含量越多，說明植物體耐鹽性越強，可以將Pro作為植物抗鹽性的評價指標之一。而本研究發現，隨著鹽脅迫濃度的增加，Pro含量顯著上升，但是各品種的Pro含量與耐鹽性表現存在不一致性，劉晶等[18]的研究也得出了相同的結論。還有學者認為Pro積累的快慢可以體現植物對鹽脅迫反應的敏感程度，但其含量的高低不能反映植物的耐鹽程度[33]。因此Pro含量與植物耐鹽性的關系還需要進一步的驗證。

植物在受到鹽脅迫后會產生一系列的復雜機制來抵抗鹽害，不同測定指標下6個紫花苜蓿品種的耐鹽性存在一定的差異，因此利用多種指標進行綜合評價，能更好地反映植物耐鹽性的強弱。研究發現，中苜一號無論在哪種鹽脅迫處理下均表現出較強的耐鹽性，而阿爾岡金的耐鹽性較弱，特別是在不均勻鹽脅迫下，其水分吸收、光合作用受到抑制，細胞膜透性增加，進而引起生物量降低，屬于鹽分敏感品種。此外，品種WL298HQ在均勻和不均勻鹽脅迫下的耐鹽性差異較大，在均勻鹽脅迫下細胞膜受到氧化損傷，植株生長速率和生物量降低，表現出較低的耐鹽性。而在不均勻鹽脅迫下，WL298HQ耐鹽性中等，可能由于不均勻鹽脅迫下該品種的某一耐性機制保護了植物細胞膜免受損傷，提高了生長速率和生物量。值得注意的是，在0/200 mmol·L-1NaCl處理下，WL298HQ具有相對較高的水分吸收含量和地下生物量，根據前人關于不均勻鹽脅迫對植物影響的研究[7]，認為無鹽一端根的補償性生長和補償吸水作用可能在其不均勻鹽脅迫下提高耐鹽性中發揮重要作用?？梢酝茢郬L298HQ在均勻和不均勻鹽脅迫下的耐鹽機制不同，在今后的研究中值得深入探討。

4 結論

不論在哪種鹽脅迫(均勻、不均勻)處理下，各紫花苜蓿品種均表現為生長速率下降，地上、地下生物量降低，水分吸收和葉綠素含量減少，膜透性、MDA和Pro含量增加，鹽脅迫抑制了植物生長，且各指標存在品種差異。通過對各個指標進行綜合評價得出，均勻和不均勻鹽脅迫下各品種的耐鹽性不同，在均勻鹽脅迫(100 mmol·L-1和200 mmol·L-1NaCl)處理下各品種的耐鹽性為中苜一號>WL354HQ>WL343HQ>WL353LH>阿爾岡金>WL298HQ，而在不均勻鹽脅迫(0/200 mmol·L-1NaCl)處理下則為中苜一號>WL354HQ>WL298HQ>WL343HQ>WL353LH>阿爾岡金。中苜一號在不同鹽脅迫處理下均表現出較高的耐鹽性，而阿爾岡金耐鹽性較差，WL298HQ在均勻與不均勻鹽脅迫下的耐鹽性差異較大，其他品種的耐鹽性居中。