Podoplanin標記的微淋巴管密度與結直腸癌淋巴轉移的關系

于愛軍 趙魯文 陳凱 劉金龍 傅華 李劍

【摘? 要】目的：研究結直腸癌組織中podoplanin標記微淋巴管的特點，探討其與腫瘤淋巴結轉移的關系。方法：收集承德醫學院附屬醫院手術切除結直腸癌和癌旁組織標本34例及正常結直腸組織標本20例，用MaxVision法免疫組織化學染色檢測podoplanin表達，計算podoplanin標記的微淋巴管密度（MLVD），并結合結直腸癌臨床病理特征進行相關性分析。結果：結直腸癌旁MLVD（22.53±4.93）明顯高于腫瘤中心區（7.44±1.78）（P<0.01），兩者均明顯高于正常結直腸組織（5.40±1.88）（P<0.01）。結直腸癌旁高MLVD與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes分期（P<0.01）有關，與患者的性別、年齡均無關。結論：結直腸癌旁高MLVD與腫瘤組織的淋巴結轉移密切相關。腫瘤旁MLVD是判斷腫瘤淋巴管生成和淋巴結轉移的重要指標。

【關鍵詞】結直腸癌;Podoplanin;淋巴結轉移;微淋巴管密度;免疫組織化學

結直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康，其發病率在我國高居惡性腫瘤第三位。淋巴道轉移是其轉移的主要途徑，大多數結直腸癌早期就可以發生淋巴轉移^[1]。近年來隨著新型淋巴管標記物的出現，腫瘤新生淋巴管形成與腫瘤轉移的關系逐漸成為研究的熱點。本研究運用免疫組織化學方法檢測Podoplanin在34例結直腸癌中的表達，計算結直腸癌中微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density， MLVD），探討它們與結直腸癌淋巴結轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集承德醫學院附屬醫院2017年5月～2018年5月手術切除結直腸標本34例，其中男性20例，女性14例;年齡35～78歲，中位年齡53.6歲。組織學分型：高分化腺癌8例、中分化腺癌16例、低分化腺癌10例。臨床Dukes分期： A+B期18例、C+D期16例。全部病例術前均未行化療或放療，術后均經病理確診。每例標本取結直腸癌、癌旁組織（距瘤緣小于1cm）各1塊。另外隨機選取其中20例距離腫瘤10cm以上遠的組織作為正常對照。

1.2方法

全部標本經4%甲醛固定、石蠟包埋、連續切片（厚4μm）、常規HE染色及免疫組化MaxVision兩步法染色。兔抗人Podoplanin單克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，MaxVision試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司，操作按照試劑盒說明書進行?？乖迯筒捎肊DTA（PH8.0）高壓鍋高溫修復，DAB顯色，中性樹膠封片。

1.3 淋巴管計數

Podoplanin陽性染色定位于淋巴管內皮細胞的細胞質，呈棕黃色顆粒狀。參照Weidner報道的方法對微淋巴管密度進行計數，Podoplanin染色后，單個內皮細胞或內皮細胞簇著色陽性分別計為一個陽性微淋巴管，不一定要找到完整的管狀結構，先在低倍鏡（×40倍）下分別選取結直腸癌周邊區、中心區以及正常結直腸組織Podoplanin染色陽性微淋巴管最豐富的區域，即“熱點（hot spots）”，然后在高倍鏡（×200）視野下計數MLVD，每例計數3個視野，并求其均值^[2]。

1.4 統計學處理

所有數據均用SPSS for Windows 18.0統計軟件分析處理，所有計數資料用表示，組間比較用t檢驗，檢驗水準為α=0.01。

2 結果

2.1 結直腸癌及癌旁組織中微淋巴管形態特征及淋巴管密度分析

結直腸癌旁組織MLVD明顯高于癌及正常組織（表1），癌組織內淋巴管多塌陷、閉塞，少量為狹窄的腔隙，癌旁組織淋巴管管腔形狀不規則，多有不同程度的擴張，腔內有時可見少量淋巴細胞，偶見有癌細胞。正常組織中淋巴管分布于粘膜層、粘膜下層、肌層和外膜中，形態大小不一，壁較薄。

2.2 結直腸癌組織中淋巴管密度與臨床病理因素的關系

結直腸癌中心區MLVD與結直腸癌臨床病理各因素之間無相關性。但在結直腸癌旁MLVD與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes分期（P<0.01）有關，而與患者性別、年齡均無關（表2）。

3 討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要生物學特征，也是臨床治療失敗、致死的主要原因之一^[3]。在實體惡性腫瘤中， 淋巴系統可能早于血液系統，成為腫瘤轉移的最初途徑^[4]。在腫瘤生長的早期，尤其是轉移瘤生長早期，其營養物質的提供主要靠彌散方式及微淋巴管、新生淋巴管通過擴張形式提供，且隨著腫瘤生長淋巴管數量也在增加，管壁結構發生改變^[5]，因此惡性腫瘤淋巴轉移過程中起關鍵作用的是淋巴管的生成。由于以前缺乏特異的淋巴管標志物，長期以來，對腫瘤淋巴管的研究相對滯后于對腫瘤血管的研究，隨著近年來相繼發現了腎小球足突細胞膜黏蛋白（Podoplanin），血管內皮生長因子受體（VEGFR）-3，腫瘤胚胎性抗原M-A的單克隆抗體（D2-40），淋巴管內皮透明質酸受體（LYVE）-1等能特異性標記淋巴管內皮細胞的抗體，極大地方便了對淋巴管與腫瘤關系的研究。淋巴管生成也成為腫瘤研究新的熱點， 抑制腫瘤新生淋巴管為控制腫瘤淋巴道轉移提供了新的靶點^[6]。

Podoplanin首先在患有嘌呤霉素所誘導的腎病鼠模型的腎小球足突細胞表面發現，是分子量為43KD的Ⅰ型黏液樣跨膜糖蛋白，由166個氨基酸構成，有一個單一高度保守的跨膜區域，胞內域有9個氨基酸構成，胞質內的C端有兩個潛在的磷酸化位點，胞外域有一個相對保守的6個潛在的氧連接型糖基化位點^[7]。Podoplanin主要表達于生長中和成熟的淋巴管內皮細胞表面，在血管內皮細胞上不表達，是特異性較強的淋巴管內皮細胞標記物^[8]。本研究結果顯示，未在由Podoplanin標記的微淋巴管內發現紅細胞，有的微淋巴管內可見淋巴細胞，少數微淋巴管內可以發現癌栓，血管內皮細胞均未表達，這表明Podoplanin標記微淋巴管的特異性和敏感性較好。

Schoppmann等研究發現腫瘤組織內新生淋巴管由單層內皮細胞構成，缺乏連續的基底膜，內皮細胞連接疏松，有許多潛在腔隙，通透性增加，從而使腫瘤細胞容易進入淋巴管，形成淋巴轉移^[9]。本研究結果顯示，結直腸癌組織中大多數是由單層內皮細胞構成的淋巴管，這些內皮細胞間的連接稀疏，存在很多潛在腔隙。癌旁組織的MLVD高于癌組織及正常組織，差異有統計學意義，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組，差異有統計學意義。結直腸癌中MLVD與淋巴結轉移有關，微淋巴管的形成為腫瘤轉移提供了有利條件。雖然已經證明癌組織中存在新生淋巴管，但癌組織與癌旁淋巴管形態存在明顯差異，腫瘤內部淋巴管多因腫瘤細胞的擠壓而導致塌陷、閉塞，癌旁組織的淋巴管的形態大多數是增生擴張的。腫瘤內部淋巴管可能沒有功能，功能性淋巴管主要位于癌旁，由于癌旁增生的功能性淋巴管增加了腫瘤細胞與淋巴管接觸的面積，從而促使了腫瘤的淋巴轉移^[10]。

本研究顯示，Podoplanin可以特異性標記淋巴管上皮細胞，結直腸癌癌旁MLVD與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期顯著相關，新生淋巴管在腫瘤轉移過程中有重要作用。檢測腫瘤及癌旁組織內MLVD可以作為評估結直腸癌生物學行為的一項指標。檢測MLVD可能有助于評估結直腸癌患者的預后并指導臨床治療。

參考文獻

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