法尼基轉移酶在大鼠壓力超負荷誘導的射血分數保留型心力衰竭心室重構中的作用

陳斌 許軼洲 周亮 楊建敏 葉顯華 童國新 黃進宇

心力衰竭主要分為射血分數減少型心力衰竭及射血分數保留型心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）。HFpEF 是左心室舒張功能受損但收縮功能正常的心力衰竭，目前無有效的治療措施，預后較差。甲羥戊酸途徑參與各種生命活動，也參與了多種心血管疾病的發生、發展。我們前期研究發現，HFpEF大鼠心肌組織甲羥戊酸途徑相關蛋白及下游活化的Ras蛋白表達升高，另外抑制甲羥戊酸途徑中的法尼基焦磷酸合成酶可改善HFpEF大鼠心肌重塑[1]。Ras蛋白為膜結合型三磷酸鳥苷酶，在心血管重塑方面發揮著重要作用，Ramos-Kuri等[2]通過基因工程敲除小鼠ras基因后，可減輕壓力負荷誘導的心肌肥厚。Ras蛋白的活化需要法尼基焦磷酸合成酶下游法尼基轉移酶（far-

nesyltransferase，FTase）的法尼基化[3]，為進一步研究甲羥戊酸途徑在壓力超負荷誘導的HFpEF的作用機制，本研究通過抑制FTase來觀察HFpEF心肌重構情況，現將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物和藥品 選擇190～210g雄性清潔級SD大鼠30只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，自由攝食飲水。FTI276（貨號：F9553）購自美國Sigma公司，G-LISA試劑盒購自美國Cytoskeleton公司，蘇木精染液、伊紅染液均購自谷歌生物，中性樹膠、二甲苯、無水乙醇均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗分組 采用隨機數字表法將雄性SD大鼠分為手術組、FTase抑制組（FTI組）及假手術組，每組10只，3組大鼠術前禁食24h，禁水12h。手術組：2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定于動物手術臺上，腹中線區剃毛、消毒、剪開腹壁，切口長度約3cm，暴露出腹主動脈，在發出右腎動脈上方5mm處，用手術線（4-0）把腹主動脈和兩端磨鈍的22G注射器針頭一起扎緊，拔出針頭，造成腹主動脈在結扎點處內徑縮窄（腹主動脈在結扎點恢復再通后的內徑為22G針頭外徑），小腸復位，關腹。FTI組：麻醉、暴露腹主動脈、腹主動縮窄等步驟同手術組，關腹后腹部皮下注射FTI276，每隔1d以300μg/kg持續注射8周。假手術組：麻醉及暴露腹主動脈同手術組，但不結扎腹主動脈，小腸復位，關腹。

1.3 觀察指標 （1）心臟超聲指標：大鼠麻醉后，剃除胸部被毛、消毒，取左側臥位。M型超聲圖像長軸切面分別測量左心室收縮末期內徑（LVIDs）和舒張末期內徑（LVIDd）；舒張末期室間隔厚度（IVSd）和左心室后壁厚度（LVPWd）；系統計算出左心室射血分數（LVEF）和左心室短軸縮短率（shortening fraction，FS）。采用脈沖多普勒經心尖部四腔切面測量左心室早期充盈流入峰值速度（E峰）和晚期充盈流入峰值速度（A峰），由此計算出E/A比值。同時計算二尖瓣E峰減速時間（deceleration time，DT）。各指標均在連續3個心動周期上測量取平均值。（2）血壓、左心室肥厚指數及Ras蛋白活性：采集完大鼠心臟超聲指標第2天，麻醉大鼠并分離出右頸總動脈，將與壓力換能器及Medlab生物信號采集處理系統連接的聚乙烯管插入右頸總動脈，采集收縮壓、舒張壓及左心室舒張末期壓力（LVEDP）。處死大鼠后取出心臟并分離出左心室稱重，計算左心室質量與體重的比值（left ventricular weight/body weight，LVW/BW），剪取一部分左心室組織置于10%中性甲醛溶液固定24h，石蠟包埋，用于HE和Masson染色。酶標儀在吸光度490nm處檢測左心室組織Ras蛋白活性。

1.4 統計學處理 采用SPSS24.0統計軟件，符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠血壓及左心室指標比較 見表1。

表1 3組大鼠血壓及左心室指標比較

由表1可見，與假手術組比較，手術組收縮壓與舒張壓明顯升高，左心室質量及LVW/BW增加，差異均有統計學意義（t=12.01、16.11；10.91、6.18，均P＜0.01）。FTI組較手術組血壓無降低，但左心室質量及LVW/BW均減少，差異均有統計學意義（t=-2.23、-6.21，均P＜0.05）。

2.2 3組大鼠心臟超聲比較 3組大鼠心臟超聲指標比較見表2。3組大鼠左心室M型超聲比較見圖1。

由表2可見，與假手術組比較，手術組IVSd與LVPWd均明顯升高，差異均有統計學意義（t=9.33、6.76，均P＜0.01）；與假手術組比較，手術組E/A比值明顯降低，DT明顯延長，差異均有統計學意義（t=-2.72、4.34，均P＜0.05）。與手術組比較，FTI組IVSd與LVPWd均明顯降低，差異均有統計學意義（t=-3.48、-3.56，均P＜0.05）。由圖 1 可見，手術組IVSd、LVPWd 均較假手術組增厚，FTI組 IVSd、LVPWd較手術組降低。

表2 3組大鼠心臟超聲指標比較

圖1 3組左心室M型超聲比較（A：FTI組；B：手術組；C：假手術組。圖中虛線為測量線）

2.3 3組左心室心肌及左心室心肌內血管的病理圖見圖2（見封三）。

圖2 3組左心室心肌及左心室心肌內血管的病理圖（A：FTI組，H E染色，×400；B：手術組，H E染色，×400；C：假手術組，H E染色，×400；D：FTI組，M asson 染色，×400；E：手術組，M asson 染色，×400；F：假手術組，M asson 染色，×400）

通過計算3組左心室心肌細胞橫截面積發現：與假手術組比較，手術組心肌細胞橫截面積明顯變大[（304±21）μm2vs（409±34）μm2]，差異有統計學意義（t=10.26，P＜0.01），FTI組心肌細胞橫截面積（354±35）μm2較手術組（409±34）μm2變小，差異有統計學意義（t=-3.76，P＜0.05）。另外，Masson染色發現腹主動脈縮窄可引起心肌內血管周圍纖維化，而FTI276可改善血管周圍纖維化。

2.4 3組左心室心肌組織Ras蛋白活性比較 手術組左心室組織Ras蛋白活性[（0.632±0.064）nm]高于假手術組[（0.412±0.043）nm]，差異有統計學意義（t=2.76，P＜0.01），而FTI組Ras蛋白活性[（0.544±0.044）nm]較手術組[（0.632±0.064）nm]降低，差異有統計學意義（t=-2.23，P＜0.05）。

3 討論

高血壓是引起HFpEF的一個主要危險因素，高血壓患者中一半有左心室舒張功能障礙，基于高血壓的高發病率，探索高血壓導致的HFpEF迫在眉睫。

Ras蛋白是參與重要信號傳導通路的小G蛋白，這些蛋白存在于所有的真核生物，在一系列的生理過程中發揮著重要作用，如細胞增殖、分化及干細胞多能性[4]。研究發現Ras蛋白與許多心血管疾病相關[5]，抑制Ras蛋白后可減輕心肌肥厚，甚至可延緩代償性心肌肥厚到舒張功能障礙的轉變[6-7]。Ras蛋白轉錄后需要一系列的修飾才能與細胞膜結合，在這里Ras蛋白與細胞膜上的受體結合，從而激活下游的信號通路[8]。Ras蛋白轉錄后修飾的第一步也是最關鍵一步，是其羧基末端與法尼基的共價結合，即法尼基化，FTase是胞質內Ras蛋白法尼基化的限速酶，且這個過程是不可逆的，法尼基化后的Ras蛋白才能與細胞膜結合，發揮活性作用[9-10]。因此抑制FTase可阻止Ras蛋白與細胞膜結合，從而抑制其激活的一序列信號通路。從細胞到動物模型，FTase抑制劑在治療腫瘤已取得一定成效，部分FTase抑制劑已經進行了臨床試驗[11-12]。

當血壓升高時，左心室后負荷增加，為了維持恒定的室壁張力，心肌發生肥厚及纖維化，這是一個正常的生理調節過程。但如果壓力超負荷持續存在，則進展成病理性心室重構，過度的心肌肥厚及纖維化將影響左心室舒張功能，最后導致舒張功能障礙[13]。部分研究發現HFpEF的嚴重程度和心肌纖維化成正比[14]。本研究發現，FTase抑制劑可直接引起心肌Ras蛋白活性下降，同時可改善心肌肥厚及纖維化，但并沒有引起血壓明顯下降。因此，我們推測，FTase抑制劑是直接改善心肌肥厚和纖維化，而不是通過降低血壓來影響心肌重塑。本研究并未發現FTase抑制后左心室舒張功能得到改善，這可能有多方面的原因，筆者認為藥物干預的時間不夠長可能是其中原因之一。

結合筆者以往及本次研究，我們可以推測Ras蛋白在大鼠壓力超負荷誘導的HFpEF中發揮著重要作用，而FTase抑制劑也許是治療HFpEF一個潛在的藥物。