HOX轉錄反義RNA在乳腺癌中的表達及意義

趙月鳴 董 瑩 袁紅梅 邢德君

(吉林省腫瘤醫院，吉林 長春 130021)

含有豐富的長鏈非編碼RNA是多細胞動物基因組的顯著特點，長鏈非編碼RNA是轉錄長度超過200nt的一類功能性RNA，其本身不編碼蛋白，主要以RNA的形式在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后調控等多個層面發揮調控基因的作用。長鏈非編碼RNA在機體幾乎所有的病理生理過程中發揮作用，和多種腫瘤的發生發展關系密切。HOX轉錄反義RNA(HOTAIR)存在于HOX基因中，是具有反式作用的長鏈非編碼RNA，最近的研究發現，HOTAIR和腎癌、肝癌、卵巢癌、食管癌、直腸癌等多種惡性腫瘤的關系密切〔1，2〕，HOTAIR在乳腺癌發生發展中的作用也被不少研究證實：HOTAIR在乳腺癌血漿和乳腺癌組織中的表達水平升高，能夠抑制乳腺癌細胞增殖，促進乳腺癌細胞凋亡等〔3～5〕。本文對乳腺癌組織中HOTAIR和其調控基因HOXD10的表達情況及HOTAIR基因的甲基化情況進行研究，探討HOTAIR基因在乳腺癌發生發展中的可能機制。

1 資料與方法

1.1標本來源 選擇2017年1～12月吉林省腫瘤醫院普外科和乳腺外科45對手術切除乳腺癌組織、正常癌旁組織、前哨淋巴結組織、腋窩淋巴結組織，乳腺癌組織均病理診斷為乳腺浸潤性癌；前哨淋巴結組織病理證實有2枚以上乳腺癌轉移；癌旁組織和腋窩淋巴結組織均病理診斷為正常乳腺組織和腋窩淋巴結組織。45例標本均來源于女性患者，平均年齡(41.3±4.2)歲，腫瘤大小(3.4±1.2)cm，腫瘤分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期27例、Ⅲ期8例，Ki-67 為(38.4±21.3)%，孕激素受體(PR)陽性30例，雌激素受體(ER)陽性32例。所有患者手術術前未進行放化療治療。

1.2主要試劑和儀器 逆轉錄反應試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、DNA提取試劑盒Trizol(Ambion公司)，RNAlater solution(Invitrogen公司)，瓊脂糖(Ambion公司)，氯仿異丙醇(上海生工)，DNA甲基化轉化試劑盒(天根生化科技有限公司)，實時熒光定量儀(美國ABI公司)。

1.3實驗方法 提取總RNA：將組織標本采用RNAlater solution保存于冰箱中，提取RNA時取出冰箱中標本，室溫下解凍，采用異硫氰酸胍-苯酚法提取RNA：稱取組織0.05～0.10 g加入Trizol研磨為顆粒狀，室溫下使核酸蛋白復合物分離，加入氯仿震蕩，離心，取上層水相至新管中，加入異丙醇，離心，得到RNA沉淀，室溫下干燥RNA沉淀。RNA質量檢測：采用分光光度儀測定OD260值和OD280值，計算RNA濃度，RNA濃度=40×稀釋倍數×OD260，計算OD260值/OD280值，OD260值/OD280值在1.8～2.0為純度滿意；用RNA電泳檢測RNA完整性。

1.4不同組織標本中HOTAIR基因及其調控基因HOXD10表達量的測定 設計PCR引物，將乳腺癌組織癌旁組織總RNA逆轉錄為cDNA，反應條件為42℃1 h，95℃ 5 min。在PCR的基礎上加入熒光染料進行實時熒光定量測定乳腺癌組織、癌旁組織、前哨淋巴結組織及腋窩淋巴結組織中HOTAIR基因及其調控基因HOXD10的表達量。

1.5乳腺癌組織及癌旁組織中HOTAIR基因的甲基化測定 提取乳腺癌組織和癌旁組織基因組DNA，用亞硫酸鹽處理DNA，設計相應的非甲基化和甲基化引物序列，進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒別DNA序列的甲基化情況。

1.6觀察指標 ①比較乳腺癌、癌旁組織中HOTAIR、HOXD10相對表達量、HOTAIR非甲基化情況；②分析乳腺癌組織中HOTAIR基因與Ki-67和雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)相關性；③比較前哨淋巴結中腋窩淋巴結組織中HOTAIR相對表達量；④分析前哨淋巴結組織中HOTA1R與Ki-67及淋巴結轉移的相關性。

1.7統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t及χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析。

2 結 果

2.1提取RNA的質量判斷 乳腺癌組織中OD260/OD280比值為(1.87±0.08)，RNA濃度為(1.67±0.06)μg/μl；癌旁組織中OD260/OD280比值為(2.08±0.11)，RNA濃度為(2.11±0.13)μg/μl。OD260/OD280比值在1.8～2.0范圍內為滿意純度，故乳腺癌組織和癌旁組織提取的RNA均為滿意純度。RNA電泳結果顯示有18 S和28 S兩條清晰的條帶，肉眼見28 S條帶亮度是18 S條帶的1～2倍(見圖1)，表示RNA沒有降解。

1～6：為6個樣本圖1 部分樣本RNA電泳圖

2.2乳腺癌及癌旁組織中HOTAIR基因和HOXD10基因的表達情況 乳腺癌組織中HOTAIR相對表達量(10.22±3.65)顯著高于癌旁組織(5.43±2.19，t=8.364，P=0.000)，乳腺癌組織中HOXD10相對表達量(10.79±2.13)與癌旁組織比較差異無統計學意義(10.16±2.35，t=0.845，P=0.362)。

2.3乳腺癌及癌旁組織中HOTAIR基因甲基化比較 乳腺癌組織和癌旁組織中HOTAIR基因均有非甲基化出現，乳腺癌組織中HOTAIR基因非甲基化率〔88.9%(40/45)〕顯著高于癌旁組織〔44.4%(20/45),χ2=20.000,P=0.000〕。

2.4乳腺癌組織中HOTAIR基因與免疫組化指標的關系 HOTAIR基因與Ki-67和PR呈正相關(r=0.810，P=0.000；r=0.623,P=0.018)，與ER無顯著相關性(r=0.514,P=0.087)。

2.5前哨淋巴結、腋窩淋巴結組織中HOTAIR的表達情況 前哨淋巴結組織中HOTAIR相對表達量顯著高于腋窩淋巴結組織(9.27±1.19 vs 6.86±1.24,t=3.397,P=0.006)。

2.6前哨淋巴結組織中HOTAIR與Ki-67和淋巴結轉移的關系 前哨淋巴結組織中HOTAIR與Ki-67和淋巴結轉移率呈正相關(r=0.803，P=0.000；r=0.687，P=0.017)，與淋巴結轉移數目無顯著相關性(r=0.384，P=0.121)。

3 討 論

HOTAIR為長鏈非編碼RNA，長度2.2 kb，不編碼蛋白質，和多硫蛋白抑制性復合物2關系比較密切，多硫蛋白抑制性復合物2介導發育中控制分化的大量基因的轉錄表達，HOTAIR可以連接不同的組蛋白修飾復合物，能夠和H3K27及多硫蛋白抑制性復合物2連接，其與染色體的作用和基因沉默及多硫蛋白抑制性復合物2重定位相關，HOTAIR和多種惡性腫瘤的發生關系密切〔6，7〕。HOXD10基因能夠抑制新生血管的生成，能夠借助上皮細胞維持其分化表型，HOXD10基因可能為細胞侵襲的抑制基因，在乳腺癌的發生發展中抑制乳腺癌細胞的侵襲和移行。HOTAIR基因和乳腺癌的關系被不少研究證實，在乳腺癌組織和轉移性乳腺癌中表達量均升高，和乳腺癌的死亡率關系密切等〔8～10〕。張開炯等〔11〕研究發現乳腺癌患者血漿和乳腺癌組織中HOTAIR基因呈高表達，血漿中HOTAIR水平和淋巴結轉移和雌激素受體顯著相關，血漿中HOTAIR診斷乳腺癌的曲線下面積為0.82，靈敏度為73.3%，特異度為93.3%，認為血漿中HOTAIR的高表達可以作為乳腺癌診斷的標志物；楊韜等〔12〕干涉HOTAIR基因的表達能夠抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖，促進其凋亡。本研究結果發現乳腺癌組織中HOTAIR表達量升高與上述研究結果一致，提示HOTAIR和乳腺癌的發生發展及乳腺癌的侵襲轉移關系密切。本文結果還發現乳腺癌組織中HOTAIR的調控基因HOXD10沒有明顯變化，可能為HOTAIR在乳腺癌中通過建立其他新的調控關系發揮作用，也可能和本實驗樣本量少，存在實驗誤差有關。

DNA甲基化在基因表觀調控修飾中發揮重要作用，誘發腫瘤發生的重要機制之一為基因調控區域CpG島的異常去甲基化和甲基化，人類基因的非甲基化和甲基化水平處于平衡狀態下，如果非甲基化和甲基化失去平衡，則可能會發生腫瘤或者其他疾病〔13〕，長鏈非編碼RNA在基因調控修飾方面也發揮重要作用，在對基因的調控修飾中兩者可能協同發揮作用，也可能單獨發揮作用。本研究結果發現乳腺癌組織中HOTAIR基因非甲基化率顯著高于癌旁組織。DNA的低甲基化能夠促進細胞的克隆，形成腫瘤的細胞一般為低甲基化的細胞，本研究結果表明HOTAIR基因在乳腺癌發生發展中的作用可能和HOTAIR基因的低甲基化有關。

孕激素和乳腺細胞增生關系密切，孕激素水平升高能夠使乳腺組織對孕激素的感受性增強，促進乳腺增生甚至發生乳腺癌；Ki-67能夠反映腫瘤增殖活性，是和細胞增殖關系密切的核抗原，乳腺癌組織中Ki-67陽性表達的細胞增殖活躍、惡性程度高、侵襲性強、腫瘤生長快、轉移率高，預后比較差〔14，15〕。乳腺癌的發生發展和Ki-67及雌激素受體關系密切。本結果表明HOTAIR基因、Ki-67、孕激素受體在乳腺癌的發生發展及乳腺癌的侵襲轉移中可能存在一些共同作用機制。