包紅桃 謝知慧 李應福 王寶泉 晏 鵬 董娟娟 劉雙萍 武權生
(甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州 730000)
卵巢儲備功能(OR)是指卵巢皮質區卵泡生長、發育、形成可受精卵泡的能力,反映女性生育潛能和生殖內分泌功能〔1,2〕。卵巢儲備功能下降(DOR)指卵巢產生卵子能力減弱、卵泡質量下降,導致女性生育能力下降及性激素缺乏,臨床多表現為月經稀發、經期不規則、閉經、不孕等〔3〕,DOR時卵巢抑制素生成減少,對垂體的抑制作用減弱使促卵泡生成素(FSH)分泌增加,而內源性FSH 的持續升高可加速竇卵泡的消耗。如不積極干預最終將導致卵子的耗竭發生卵巢早衰,失去最佳治療機會。DOR發生與年齡、婚育狀況、宮腔操作次數、心理、吸煙、減肥藥服用史、雷公藤服用史、卵巢手術史、腮腺炎病史等諸多因素有關〔4〕。DOR發生率為10%〔5〕,是一個漸進性過程,常在 1~6 年內發展為卵巢衰竭?,F有DOR中醫、西醫治療手段都有不同的局限性〔6~12〕。近年來,致力于中醫藥改善OR的研究、探索日益增多,并已取得顯著臨床療效。傳統中醫診治疾病的整體觀念與辨證論治原則顯得尤為重要。本研究旨在闡釋中醫藥改善DOR的優勢。
1.1實驗動物 采用自然老化的初老模型,SPF級SD大鼠,雌性,12~13月齡,體重240~440 g;5月齡青年大鼠,體重180~220 g。由甘肅中醫藥大學SPF級實驗室提供。實驗過程室溫保持(21±2)℃,相對濕度60%~70%,動物購進后適應性喂養4 d。
1.2實驗藥物 所需中藥材均由甘肅中醫藥大學附屬醫院中藥房同一批購進。戊酸雌二醇片(補佳樂,生產廠家:拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司,批號:國藥準字J20130009,劑型:片劑,規格:1 mg×21片,批號:國藥準字J20130009)。實驗試劑:FSH和黃體生成素(LH)試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司。
1.3實驗方法 以陰道上皮角化試驗驗證模型〔13,14〕。按大鼠動情周期陰道涂片的細胞變化特點來劃分動情周期的各階段。通過陰道脫落細胞分析對60只13周齡SD雌性初老大鼠連續15 d進行陰道涂片、鏡檢,觀察陰道組織涂片中細胞的變化,記錄圖像并分析。篩選出50只動情周期紊亂、動情間期延長提示DOR模型大鼠后隨機分為模型組、組方高劑量組、組方中劑量組、組方低劑量組、補佳樂組。5月齡雌性大鼠10只為青年組。
1.3.1給藥 除模型組、青年組灌服等體積生理鹽水外,其余各組均按體表面積折算成人的等效劑量給藥,組方高(2.12 g·kg-1·d-1)、中(1.06 g·kg-1·d-1)、低劑量組(0.53 g·kg-1·d-1),每日2次;補佳樂組0.03 g·kg-1·d-1,1次/d,均連續7 d。
1.3.2標本采集 陰道脫落細胞采集方法:用自制的無菌棉簽蘸取少量生理鹽水浸濕后插入大鼠陰道,充分蘸取分泌物后取出,在玻片上輕輕滾動,使分泌物均勻涂布于玻片上,待涂片自然風干后,以95%的酒精固定、瑞氏染色。最后一次灌胃后1~2 h眼眶采血,離心后,取上清液,用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)監測FSH、LH(按試劑盒說明操作),處死大鼠摘取卵巢,用10%的甲醛溶液固定,石蠟包埋切片,常規蘇木素-伊紅(HE)染色,在光鏡下觀察卵泡數量。
1.4統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析,方差齊者采用Bonferroni法,方差不齊者采用DunnettT3法。
2.1各組血清FSH、LH的表達 與模型組比較,組方高、中、低劑量組、補佳樂組血清FSH、LH明顯降低(P<0.05),模型組血清FSH、LH值顯著高于青年組(P<0.05);補佳樂組血清FSH、LH值顯著低于組方高、低劑量組(P<0.05),而與組方中劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05);組方高、中、低劑量組、補佳樂組能明顯降血清FSH、LH表達水平,且中劑量組效果最顯著(P<0.01)。見表1。
2.2各組卵泡數量 青年組表現為卵巢體積大,卵泡生長活躍,可見各級卵泡,顆粒細胞層次多,卵泡液含量多,黃體發育良好,體積大,血管豐富;模型組可見卵巢萎縮,卵泡數減少,無黃體,卵母細胞顆粒層數減少,閉鎖卵泡數增多,卵泡內細胞排列出現紊亂;組方高、低劑量組可見卵巢略有萎縮,卵泡數略有增多,黃體數量略少,卵母細胞顆粒層數較多;組方中劑量、補佳樂組可見卵巢體積正常大小,各級卵泡數均較多,卵泡液含量多,黃體數較多,卵母顆粒細胞層次增多,以組方中劑量組尤為明顯。見圖1。
表1 各組血清 FSH、LH表達水平
與青年組比較:1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.05,3)P<0.01;與補佳樂組比較:4)P<0.05
圖1 各組卵巢組織中卵泡數量(×10)
中醫藥防治DOR從多方面、多環節入手,對人體具有整體調節作用,中醫藥補腎活血,調肝健脾、滋陰補腎、補腎祛瘀等效果顯著〔15,16〕。西醫常采用激素治療DOR,但其副作用較大,患者服藥期間易擅自停藥等。應用“肝腎同源,精血互生”病機理論,從整體出發,辨證論治,具有整體調控和多靶點、多方式調節的特點。臨床經驗方滋養肝腎組方加以優化后篩選出以炙黃芪35 g、淫羊藿15 g、生地12 g、熟地15 g、枸杞15 g、當歸20 g、鹽澤瀉12 g、茯苓15 g、太子參30 g、麩炒白術18 g、陳皮6 g、女貞子15 g、酒萸肉12 g、炒山藥15 g、炒白芍15 g、墨旱蓮15 g、何首烏15 g、酒黃精15 g、鹿角膠10 g、龜甲膠15 g、甘草6 g具有地域特色藥材為主的基本配伍組方,本研究說明滋養肝腎組方通過滋養肝腎調節機體生殖內分泌功能,改善DOR的作用,從而穩定機體內環境。