苗藥紫金龍中生物堿含量的酸性染料比色法測定△

楊雅欣 徐仕娟 馮小翠 羅國勇 張敬杰

(1.貴陽中醫學院 貴州省苗醫藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2. 貴陽中醫學院第二附屬醫院，貴州 貴陽 550002)

紫金龍為毛茛科烏頭屬植物深裂黃草烏(Aconitum vilmorinianum var. altifidum W. T. Wang)的根及根莖。收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》(2003版)。是苗族習用藥材，具有祛風除濕，溫經止痛的功效，用于治療風濕性關節炎等病癥[1]。據文獻報道，該屬植物中的化學成分包括生物堿、黃酮、甾體及糖苷類等，其中有效成分及特征成分主要為二萜生物堿類[2-4]。因二萜生物堿類化合物廣泛的生物活性，一直是藥物學家尋找新藥的一個重要來源[5]。

目前，未見紫金龍總生物堿含量測定的文獻報道。酸性染料比色法是測定中藥總生物堿含量的一種經典方法[6-7]，本文擬通過紫外-可見分光光度計，利用酸性染料比色法測定苗藥紫金龍中總生物堿的含量。旨在建立紫金龍提取物中總生物堿含量測定的方法，為其質量評價提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 紫外可見分光光度計(UV-500，上海元析儀器有限公司)，超聲波清洗器(SK8210HP，上?？茖С晝x器有限公司)，恒溫水浴鍋(DRHH，上海雙捷實驗設備有限公司)，分析天平(AR2140，上海奧豪斯有限公司)。

1.2 試藥 烏頭堿對照品(302-27-2，貴州迪大科技有限責任公司，純度≥98%)；無水乙醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)，石油醚(分析純，天津市凱信化學工業有限公司)，正丁醇(分析純,天津市富宇精細化工有限公司)，氯仿(分析純，西隴化工股份有限公司)，甲醇，氫氧化鈉等均為分析純；溴甲酚綠(指示劑,天津市科密歐化學試劑有限公司)，實驗用水為蒸餾水。

1.3 藥材 藥材購自貴陽市萬東橋中藥市場，經貴陽中醫學院孫慶文教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物深裂黃草烏Aconitum vilmorinianum var. altifidum W. T. Wang的根莖。

2 方法與結果

2.1 試液溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取紫金龍藥材粉末(過60目篩)2.0g于25mL的圓底燒瓶中，按紫金龍最佳提取方案[8]，加入固液比1:8 的65%乙醇溶液16mL，85℃水浴回流提取2.5h，冷卻，過濾，70℃蒸干溶劑，浸膏加入75%乙醇15mL使之溶解，轉入分液漏斗中，分別用等體積的石油醚、氯仿、正丁醇依次萃取3次，合并萃取液，取氯仿萃取液所得浸膏用75%乙醇5mL溶解至完全，精密量取0.3mL于5ml容量瓶中，75%乙醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取烏頭堿對照品5.0mg，甲醇定容至5mL，制得1.0mg/mL對照品貯備液，逐級稀釋，得到0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的烏頭堿對照品溶液。

2.1.3 酸料染料的制備[9]0.05mol/L氫氧化鈉溶液的配制：精密稱取氫氧化鈉0.2g于100mL錐形瓶中，加入蒸餾水使之溶解并稀釋至刻度，即得。

溴甲酚綠緩沖液的配制：精密稱取溴甲酚綠0.1g，加入0.05mol/L氫氧化鈉2.8mL使之溶解，再加水稀釋至200mL，即得。

2.2 測定條件的選擇

2.2.1 酸性染料的顯色方法 精密吸取烏頭堿對照品或供試品溶液1.2mL置60mL的分液漏斗中，分別加入溴甲酚綠溶液24mL和氯仿12mL，密塞劇烈振搖20min，靜置分層10min，取氯仿層進行紫外-可見光檢測。

2.2.2 測定波長的選擇 以2.1.1，2.1.2的方法分別制備供試品及對照品溶液，并按照2.2.1的顯色方法顯色，在190～800nm波長范圍內進行光譜掃描，考察吸收波長。結果表明，供試品在410～420nm處有最大吸收，烏頭堿對照品在410～415nm處有最大吸收峰，綜合考慮，最終選擇415nm作為實驗檢測波長。

2.3 酸性染料比色法的方法學考察

2.3.1 標準曲線的制備 精密稱取烏頭堿對照品5.0mg，甲醇定容至5mL，制得1.0mg/mL對照品貯備液，逐級稀釋，得到0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的烏頭堿對照品溶液。分別精密吸取1.2mL置60mL的分液漏斗中，加入溴甲酚綠溶液24mL和氯仿12mL，密塞劇烈振搖20min，靜置分層10min，取氯仿層于415nm波長處測定吸光度值。以對照品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制曲線，得回歸方程為Y=2.76X+0.0386(r=0.999，n=5)。結果表明，烏頭堿的濃度在0.1mg/mL-0.3mg/mL范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取濃度為0.2mg/mL的烏頭堿對照品置于分液漏斗中，按“2.2.1”項下的操作方法，取氯仿層于415nm波長處測定吸光度，連續測定6次，測得RSD = 0.74%，說明儀器所測得數據準確可靠。

2.3.3 重現性試驗 取同一批紫金龍藥材細粉6份，每份2.0g，按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液6份，每份1.2mL，依“2.2.1”項下方法處理顯色后，于415nm波長處測定吸光度，結果紫金龍中總生物堿平均含量為7.82mg/g，RSD = 1.43%，表明實驗方法重現性良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液1.2mL，依“2.2.1”項下方法處理顯色后，分別在0,20,40,60，80,100min于415nm波長處測定吸光度，結果RSD = 0.80%，表明供試品溶液在100min內基本穩定。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的紫金龍藥材粉末6份，分別加入等量烏頭堿對照品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，依“2.2.1”項下方法處理顯色后，于415nm波長處測定吸光度，根據回歸方程計算回收率。結果見表1。

表1 紫金龍總生物堿加樣回收率測定結果

2.3 樣品的含量測定 取4個批次的紫金龍提取物，每個批次平行測定3次，每次精密量取1.2mL，依“2.2.1”項下進行酸性染料比色，取氯仿層于415nm波長處測定吸光度，根據標準曲線計算紫金龍總生物堿的含量，得出紫金龍中總生物堿平均含量為7.27mg/g。

表2 紫金龍提取物中總生物堿含量測定結果(n=3)

3 討論

酸性染料比色法是生物堿類化合物與氫離子生產陽離子，酸性染料比色與其定量結合成有色絡合物，被有機溶劑提取，在一定波長處測定其吸光度，即可計算總生物堿的含量[6]。酸性染料比色法所測定的結果較準確，應用較多。

本實驗采用酸性染料比色法，通過紫外-可見分光光度計檢測對苗藥紫金龍藥材總生物堿進行定量分析，建立其中總生物堿含量測定的方案。測得紫金龍提取物中總生物堿的含量平均為7.27 mg/g。該方法具有一定的專屬性和準確度，靈敏度高，簡便易行，適宜紫金龍藥材中總生物堿含量測定。