發作性睡病1型的免疫學研究進展

徐 濤， 吳惠涓， 趙忠新

發作性睡病是一類以日間過度思睡、猝倒發作和夜間睡眠障礙為主要特征的慢性睡眠障礙，可伴有體重增加，入睡前幻覺和心理障礙等臨床表現[1]。根據國際睡眠障礙第三版(ICSD-3)的分類，發作性睡病被分為兩型[1]：1型，伴猝倒發作，患者腦脊液中下丘腦分泌素-1(Hypocretin-1，Hcrt-1)水平有明顯下降；2型，不伴猝倒發作，腦脊液中Hcrt-1水平無明顯下降。人類外側下丘腦有大約70000個生產Hcrt-1的神經元，此類神經元在1型發作性睡病患者腦內有90%～95%已缺失[2]。研究顯示，Hcrt-1是腦內重要的維持覺醒的遞質，其缺失是導致1型發作性睡病的主要病理因素[3]。因此，探究下丘腦Hypocretin能神經元損傷或凋亡的機制是明確發作性睡病病因的關鍵。

發作性睡病以散發病例為主，家族聚集性低[4]。據統計，患者一級親屬的發病風險雖是正常人群的20～40倍，但發病率僅為1%～2%；即使同卵雙胞胎的共患率也只有25%～30%。這些證據表明，發作性睡病的遺傳并非決定因素，后天獲得性的影響更為重要。長期以來，自身免疫因素被認為是特異性Hypocretin能神經元損傷的主要原因[5]，基于此類學說，我們從基因多態性、感染與疫苗、體液免疫、細胞免疫以及應激損傷五個方面，對1型發作性睡病的免疫學機制進展進行概述。

1 基因多態性研究

1.1 HLA關聯性研究 從上世紀末起，發作性睡病與人類白細胞抗原(HLA)的關聯性就已被廣泛探究，其中HLA-DQB1*06：02和DQA1*01：02兩基因座的出現頻率與發病密切相關[5，6]。研究表明，98%的1型發作性睡病患者攜帶有HLA-DQB1*06：02，而它在正常人群中的攜帶率只有12%～38%[6]，HLA-DQB1*06：02可與HLA-DQA1*01：02共同編碼主要組織相容性復合體Ⅱ型(MHC-Ⅱ)DQαβ異二聚體(DQ0602)[7]。這類異二聚體可表達于抗原呈遞細胞表面并提呈抗原肽供TCR識別。如果某個體的兩條等位基因均表達DQ0602，則發病風險將會增加2～3倍[8]。

進一步研究提示多種編碼MHC-Ⅱ類分子的基因均與發病相關，但影響程度較小，如HLA-DQB1*03：01可讓發病風險提升1.5倍[9]，在亞洲人群中，它可將發病年齡提前2歲[10]。保護性基因型的有大量報道，等位基因上DQ1族(包含DQA1*01，DQB1*05，DQB1*06) 基因座的存在則會降低風險，相關機制被稱為“等位基因競爭”[10]。HLA基因區域的一些單核苷酸多態性(SNP)也與發病相關，其中SNP rs7744293與DQB1*06：02緊密連鎖，位于HLA-DP區域的 SNP rs3117242的存在則會讓發病風險提升2.45倍[11]。

1.2非HLA基因相關性研究

近年來全基因組關聯分析(Genome-wide association study，GWAS)觀察到大量非HLA基因與發作性睡病的相關性。研究發現T細胞受體(TCR)α基因座J區域片段的某些特定變異可以顯著提升患發作性睡病的風險，其中rs1154155是可能性最高的一個SNP。多數TCR由α和β鏈構成，其中α鏈由DNA的TCR基因座上V，J區域的基因片段重組并表達形成并賦予TCR高度的多樣性[12]。某些類型的TCR對特定MHC分子(如DQ*0602)可能存在特異性識別并激活免疫反應。

其他相關的基因包括P2RY11，rs2305795A被認為是基因中與發病密切相關的一個SNP。P2RY11基因編碼一類在CD8+T細胞上表達水平很高的ATP-G蛋白偶聯受體，參與調節淋巴細胞的成熟、趨化和凋亡。2017年的一項研究報道P2RY11基因變異的患者體內找到的變異位點，可能與CD8+T細胞的功能失調有關[13]。與P2RY11基因同在一段保守序列上的還有PPAN，EIF3G和DNMT1 基因，EIF3G 基因內的SNPrs3826784也與本病相關，該基因在真核細胞蛋白質翻譯過程中有重要作用[14]。一些免疫芯片研究發現[15]，NT1患者組織蛋白酶H (Cathepsin H，CTSH)和腫瘤壞死因子超家族成員4(TNFSF4，也被稱作 OX40L)，廣泛表達于抗原呈遞細胞內，在抗原呈遞過程中有重要作用，能夠促進T細胞增殖。

近期，圍繞趨化因子受體1、3(CCR1、CCR3)基因的研究發現，CCR3基因敲除小鼠的日間睡眠片段化，當腹腔內被注射脂多糖后，小鼠日間覺醒時間延長而NREM睡眠時長縮短，尸檢發現這批小鼠外側下丘腦的Hypocretin能神經元數目下降，提示CCR3基因在睡眠-覺醒的調節及發作性睡病的發病機制中的重要角色[16]。而CCR1基因內的一個SNP rs3181077被發現可增加發病風險，攜帶該突變基因的患者體內CCR1 mRNA水平下降，且單核細胞遷移指數也有所降低[17]。

2 感染與疫苗

2.1 H1N1感染 2009～2010年甲型H1N1流感大流行與發作性睡病的發生密切相關。據報道，2010年流感結束后中國華北與華東地區發作性睡病的發病率是以往的3～4倍[18，19]，但與中國疫苗接種未顯示明顯相關性。隨后的實驗研究顯示：患者體內分離出可被HCRT56-58和HCRT87-99激活的CD4+T細胞中部分亞群可被pHA1 275-287顯著激活，后者作為甲流病毒HA抗原片段與HCRT56-58和HCRT87-99具有序列上的相似性[20]，提示流感病毒抗原模擬自身抗原產生交叉反應的可能。此外，研究發現當缺少T細胞和B細胞的小鼠(重組激活基因1缺陷小鼠)感染H1N1病毒后出現發作性睡病樣睡眠結構改變，解剖顯示病毒主要侵犯腦干和下丘腦區域，其中就包含Hypocretin能神經元，提示流感病毒直接損傷神經元的可能[21]。

2.2 疫苗 流感結束后，芬蘭和瑞典國內報道在接種名為Pandemrix的流感疫苗后，5～19歲的青少年發作性睡病發病風險增加了6～9倍[22]。Pandemrix不同之處來自AS03佐劑(角鯊烯和α-生育酚組合)而它含有α-生育酚這類促進免疫細胞遷移、細胞因子分泌、抗原呈遞的物質，并通過一種被稱作“旁觀者激活”的假說引起免疫系統廣泛激活。Masoudi等還發現α-生育酚會促進Hypocretin分泌，過量的Hypocretin可能會誘發APC對Hypocretin片段提取和呈遞[23]，該實驗結論更傾向于發病機制為T細胞的特異性識別。

2.3 鏈球菌 A組溶血性鏈球菌感染與發作性睡病也有關聯。鏈球菌抗原與人類自身抗原的相似性因風濕病而廣為人知，但既往鏈球菌感染還會使發作性睡病的發病風險提升5倍。實驗報道患者體內鏈球菌特異抗體如抗“O”抗體的陽性率為65%，而正常人群中只有26%[24]?；撔枣溓蚓乖?Streptococcus pyogenessuperantigens，SAgs)，可以與TCR結合并激活多種類型的T細胞[25]。鏈球菌的感染還會誘導T細胞分泌IL-17，并提高血腦屏障的通透性[25]，潛在增加了Hypocretin能神經元暴露于免疫系統的風險。

3 體液免疫

盡管多數研究傾向于發作性睡病1型由體液免疫途徑介導，但始終缺乏特異性自身抗原抗體存在的證據。2010年，一種名為同源性Tribbles2(TRIB2)蛋白自身抗體被發現更多地存在于患者體內(與正常人相比14%∶5%)[26]。TRIB2廣泛表達于中樞神經系統乃至免疫細胞內。將含有TRIB2自身抗體的IgG注射到裸鼠的腦室內，使其產生了發作性睡病樣表現，病理顯示裸鼠的大腦內Hypocretin能神經元、神經元特異性核蛋白和突觸素均發生丟失，提示TRIB2自身抗體不只作用于Hypocretin能神經元[27]。但目前多個研究均未發現1型發作性睡病患者的體內存在任何指向Hypocretin能神經元的自身抗體[28]或Hypocretin前體及其片段敏感的IgG[29]；多項針對已知自身抗體的篩查如anti-Ma2(參與誘發邊緣性腦炎)，NMDAR(N-methyl-D-aspartate receptor)和CASPR2(contactin-associated protein2)抗體均未有陽性發現[29～31]。神經節苷脂(GM)是流感血凝素的結合位點，在一項篩查發現患者腦內11種GM自身抗體的血清學檢測顯示抗GM3抗體陽性率(14.6%)顯著高于正常對照(3.5%)，且抗GM3抗體與HLA-DQB1*06：02之間有緊密關聯(P=0.016)[32]。這類研究表明，自身抗體通常陽性率低且特異性不足，其產生有兩種可能性：由神經元損傷所導致的繼發性免疫反應產生，或疾病未發生之前早已存在。

數項研究針對體液的細胞因子含量進行檢測以確定患者體內免疫反應的強弱。Michel等對比44例發作性睡病患者與57例其他類型睡眠增多患者的腦脊液細胞因子含量，僅有CCL3水平(趨化因子配體3)具有顯著差異(發作性睡病患者體內水平更高)，而血清IFN-γ濃度則在患者發病初期顯著升高。IFN-γ水平的上升可以反映免疫活動的增強，而CCL3單因子的改變缺乏顯著意義[33]。Dauvilliers等的研究則發現患者腦脊液中僅有IL-4含量相比正常個體顯著上升[34]，另一項對9例患者和9例正常對照的研究則未發現任何顯著的腦脊液細胞因子水平差異[35]。而重復的血清檢驗則發現相對于DQ*0602陽性正常對照，發作性睡病患者外周T細胞活化程度和TNF、IL-2等細胞因子分泌量顯著上升[36]。然而，上述研究結論差異較大，體液細胞因子水平與發病機制的聯系尚不明確，考慮到睡眠節律的改變也會作用于免疫系統，相關改變是因是果仍需進一步探究。

4 細胞免疫

在外側下丘腦，生產黑色素濃集激素(Melanin-Concentrating Hormone，MCH)神經元與Hypocretin能神經元混合分布，但患者體內MCH神經元未受損傷[2]。由于中樞缺乏自身抗體與炎癥浸潤存在的證據，CD8+T細胞參與Hypocretin能神經元特異性損傷成為另一種可能。

中樞神經系統的免疫耐受性來自于血腦屏障的阻隔以及神經元中MHC的低水平表達。但T細胞仍可通過第5腰椎和脈絡叢進入顱內。一項針對西尼羅河病毒性腦炎的實驗發現病毒侵入后受感染的神經元迅速分泌CXCL10，并招募大量表達CXCR3的CD8+T細胞進入中樞[37]。Sasaki等的一項試驗用膠質纖維酸性蛋白(GFAP)作為抗原使小鼠建立免疫應答，之后GFAP特異性CD8+T細胞會終身自發進入中樞并停留在腦膜與血管周圍，分泌少量炎性細胞因子并引發間歇性的自身免疫反應[38]。

有趣的是，制作發作性睡病小鼠模型的方法模擬了可能的發病機制，這類轉基因小鼠腦內Hypocretin能神經元能夠表達流感病毒HA抗原蛋白，在注射HLA抗原特異性CD8+T細胞后小鼠很快出現Hypocretin能神經元特異性喪失和發作性睡病樣癥狀，然而當改為注射CD4+T細胞時則無類似改變，提示CD8+T細胞介導的特異性神經元損傷的可能性[39]。

上述細胞免疫參與發作性睡病的可能機制仍然需要證據證實。值得注意的是，從H1N1的感染到發作性睡病起病常需幾個月，提示慢性免疫進程且相關免疫細胞可能只占很少一部分，因此針對發病初期患者的篩查仍難以發現免疫細胞和炎癥因子改變的證據。

5 組胺與內質網應激

2013年，一項針對發作性睡病患者的大腦尸檢顯示組胺能神經元的數量平均增加了64%[40]。研究發現組胺與腦室內皮細胞的結合可以提升血腦屏障的通透性，從而促進T細胞進入中樞[41]。組胺也可以促進小膠質細胞釋放一氧化氮并通過誘導內質網應激來損傷Hypocretin能神經元而一氧化氮對鄰近的MCH神經元影響很小，從而解釋了Hypocretin能神經元的特異性損傷[42]。組胺能神經元與自身免疫因素導致的Hypocretin能神經元損傷的相關性也被提出[43]。事實上，Hypocretin能神經元相對于MCH神經元更易受損傷，興奮性毒素如喹啉酸的作用可以通過NMDA 受體的異常激活顯著減少小鼠Hypocretin能神經元數量，而相同環境下的MCH神經元數量無明顯下降[44]。目前臨床證據顯示發作性睡病患者的腦脊液組胺水平低于或組胺通路信號傳遞受阻[45，46]。組胺參與發作性睡病的發生機制作為一類新觀點亟需進一步試驗加以明確。

6 結 語

在1型發作性睡病的免疫機制中，基因和環境因素從不同角度施加影響，導致腦內特異性Hypocretin能神經元的損毀，但仍有許多重要問題亟待研究明確。目前已發現眾多易感基因和環境誘發因素的存在，但考慮到相對較低的發病率，哪項因素才是發病的關鍵？小膠質細胞在發病進程占據怎樣的地位，尚無相關實驗報道。炎癥因子、自身抗體水平是否因為患病時間的延長而逐漸下降，以至于無法檢測？未來對流感患者或發作性睡病患者發病超早期，甚至臨床不典型期進行特異性抗體檢測和中樞的細胞免疫相關檢測，可能對發病機制的研究有所突破。此外，對發作性睡病機制的探究也將有助于高危人群的識別與預防，對核心免疫通路的理解將為治療開創新路。