針刺長強穴對自閉癥模型大鼠海馬區相關蛋白表達的影響※

俞 萍 鄭昌岳 李 鳳 蔣劍文

（福建省級機關醫院康復科，福建 福州 350001）

兒童自閉癥 (children autism，CA)又可稱為孤獨癥，是指在3歲之前發病，其主要表現癥狀為不同程度的社會交流能力缺陷、語言發育障礙、重復刻板以及狹隘的興趣等的一種疾?。?］。由于自閉癥的發病機制尚不確切，目前尚無專門針對自閉癥的特異性治療藥物，基礎研究中我們發現針刺長強穴可改善自閉癥模型大鼠學習和記憶能力［2］。已有的研究認為與自閉癥關系最密切的腦區形態結構有前額葉皮層和海馬等［3］。而 Wnt信號通路通過調控神經元發育，在早期胚胎發育中起了重要作用。因此認為此通路與自閉癥患者和動物模型早期腦的過度發育有關［4］。β-catenin是一種多功能信號蛋白，可進入細胞核內，參與基因的表達，在Wnt信號通路中處于重要地位。位于通路上游的 GSK-3β是一個最主要的負性調節因子， 有效磷酸化 β-catenin，導致 β-catenin的積聚與活化。這兩個重要蛋白直接影響著Wnt信號通路所起到的生物學功能。鑒于 β-catenin和 GSK-3β在Wnt信號通路中的關鍵作用，本實驗擬通過針刺干預自閉癥模型大鼠長強穴后，觀察這兩個信號蛋白在大鼠腦海馬內的蛋白表達情況與細胞形態的變化，以希望認識到這些變化與學習記憶功能改善之間的相關性。

1 實驗材料

1.1 主要試劑及設備 丙戊酸鈉（Sigma）；一抗β-catenin（博士德 BA0426）；一抗 GSK-3β（博士德 BA0906）；二抗sp-9001（invitrogen sp-9001）；DAB（北京中杉zli-9032）；Morris水迷宮 RB-100AV2.5.1、生物組織脫水機ZT-14S；生物組織石蠟包埋機YB-6LF；RM2015切片機（德國萊卡）

2 實驗方法

2.1 實驗動物模型制備及動物分組 本課題選取福建中醫藥大學實驗動物中心提供健康成年Wistar雄性300～350 g及雌性 200～250 g大鼠各 10只，待大鼠熟悉環境1周后，予雌、雄各一只合籠，飼養在帶有托盤的鐵籠子中并過夜，到第二天早晨9點左右，檢查到托盤中有陰栓的雌鼠記為胚胎第 1天 (Embryofoday，E1)，這時將雌、雄分籠，并將受孕母鼠放入帶有木屑的墊料籠中單獨飼養。將受孕母鼠按隨機數字表法分成 2組，1組9只孕鼠，在 E12天時給予母鼠 600 mg/kg的 VPA(用0.85%的生理鹽水配成 250 mg/mL的溶液)腹腔注射［5］，是為模型組；另外1組為1對，進行正常飼養，是為空白對照組。模型組母鼠產下的仔鼠記為模型鼠；正常對照組母鼠產下的仔鼠記為正常對照組。第23天仔鼠雌雄分籠，按隨機數字法分組，1～9號為針刺“長強”穴組，10～19號為非針刺對照模型組，即模型組；20～29號為非穴位針刺治療組。正常對照組生下 12只，隨機篩選10只為空白對照組。

2.2 針刺干預

2.2.1 穴位選擇 參照《實驗針灸學》［6］中的定位方法取長強穴：位于大鼠肛門和尾骨部之間的凹陷處；非穴為：在大鼠腋中線處，在肋弓最低點上1 cm非經非穴處。

2.2.2 刺法 仔鼠生出 23天后，針刺長強穴組以 30號0.5寸毫針 (佳健牌，無錫佳健醫療器械有限公司生產)直刺約0.2寸，非穴位針刺對照組同樣以30號0.5寸毫針直刺0.2寸，2組行平補平瀉提插手法1 min。每日于上午9時行針刺手法 1次，連續針刺10日為 1個療程，1個療程后休息 2日再行針刺治療，連續 3個療程。非針刺模型組、空白對照組僅每日模擬針刺組行抓取動作，不作治療，并在相同條件下飼養。

2.3 Morris水迷宮行為學測試 水迷宮直徑為120 cm，深為50 cm，注入水深為 30 cm，水溫控制在 22℃～25℃，通過池壁上的4個等分距離點把水池分為4個象限，并在第三象限的中央放置一直徑為12 cm，略低于水平面1.5 cm的圓形黑色平臺。水迷宮定位航行試驗：于每日上午9時開始，將大鼠沿著水池壁放入水中，從第一象限開始，通過圖像采集和處理系統記錄大鼠找到平臺所用的時間及軌跡，若大鼠在60 s內找到并站上平臺，就進行下一象限測試，如果大鼠在60 s內還未登上平臺，實驗人員就幫助大鼠站上平臺，并在平臺上站立 10 s，10 s后讓老鼠置于鼠籠中休息 1 min，之后再進行下一象限測試，第2日開始就從第2象限開始，以此類推，連續4日。

2.4 大鼠海馬區β-catenin和GSK-3β蛋白表達的觀察

2.4.1 樣品采集及處理 針刺治療結束后，參照如下方法進行取材：抓取大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，待大鼠昏迷后，將其胸腔剪開，充分暴露心臟，并剪開大鼠的右心耳放血，同時將圓頭針插入大鼠心尖，迅速向心臟內推注生理鹽水，直至觀察到從剪開的右心耳處流出清亮的液體為止，大約需推50 mL；隨后立即換針筒，保持針頭不移位，向心臟內緩慢灌入4%的多聚甲醛，待大鼠的四肢、尾巴完全僵直時，拔出針頭，斷頭，從枕骨大孔往前剪開皮膚，沿人字縫分開顱骨，暴露腦組織，并迅速剝離腦膜及神經，使之與顱骨分離，取出腦組織，浸沒于4%多聚甲醛液體中，參照大腦腦定位定向圖譜［7］，冠狀面切取前囟-3.14 mm～-6.3 mm部分約3 mm厚腦片，包埋切片后行免疫組化檢測：首先將組織切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜；之后進行脫蠟、脫水；接下來進行抗原修復及封閉。甩去多余液體，不洗；之后進行滴加一抗、二抗和顯色，最后進行蘇木素復染，并在顯微鏡下觀察。

2.5 統計學方法 以上實驗所得數據用SPSS 18.0軟件進行統計分析。平均逃避潛伏期：各組間數據采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統計意義。

大鼠海馬區 β-catenin和 GSK-3β蛋白表達的觀察：空白組、非針刺模型組、針刺長強穴組、非穴治療組組間采用圖片對比觀察，記錄陽性細胞率，采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統計意義。

3 結果

3.1 Morris水迷宮觀察結果 表1結果顯示：在水迷宮實驗中，針刺長強穴組與非針刺對照模型組相比，其逃避潛伏期所用時間明顯縮短（P＜0.05）；而空白對照組與非針刺對照模型組比，其所用時間也明顯縮短（P＜0.05），其結果均具有統計學意義。

表1 大鼠定位航行試驗潛伏期比較 （x±s，s）

3.2 大鼠海馬區β-catenin和GSK-3β蛋白表達的觀察

3.2.1 大鼠海馬區β-catenin蛋白表達的觀察結果 表2結果顯示：針刺長強穴組與非針刺對照模型組相比，其海馬區 β-catenin蛋白表達的陽性率明顯下調（P＜0.05）；而空白對照組與非針刺對照模型組比，其陽性細胞表達率也明顯下調（P＜0.05），其結果均具有統計學意義。

表2 大鼠海馬區β-catenin蛋白表達的陽性率比較 （x±s）

3.2.2 海馬區GSK-3β蛋白表達的觀察結果 表3結果顯示：針刺長強穴組與非針刺對照模型組相比，其海馬區GSK-3β蛋白表達的陽性率明顯上調（P＜0.05）；空白對照組與非針刺對照模型組、非穴治療組相比，其陽性細胞率明顯上調（P＜0.05），其結果均具有統計學意義。

表3 大鼠海馬區GSK-3β蛋白表達的陽性率比較（x±s）

4 分析與討論

兒童自閉癥，又稱兒童孤獨癥，是一種較為嚴重的發育障礙性疾病。研究認為，在遺傳與環境因素的相互作用下，可引發個體發育早期階段神經元細胞增殖、分化、凋亡與遷移異常，從而導致相關腦區形態結構異常［3］。通過大量的臨床治療和實驗研究報道發現針刺長強穴治療精神發育遲滯兒童，可提高患兒的語言、認知能力和智力［8］。長強穴，又名尾閭穴，位于尾骨尖下0.5寸，尾骨端與肛門連線的中點處，為督脈之絡穴，別走任脈?！峨y經·二十八難》中首先提出長強與腦的直接聯系，其指出：“督脈者，其余下極之俞，并于脊里，上至風府，入屬于腦”。長強為督脈的第一個穴，這里的“下極之俞”指的應該就是長強。所以可通過針刺長強，可起到通督調陽的作用，即“長強者長于陽而強于陰，生氣通于天，其質造形而通于地”，為純陽初始，使臟中生春陽氣正，舒緩各部器官，具有很好的寧神鎮痙，脊強反折，除其癲疾之功效［9］。

Wnt通路是一條對個體的早期發育，是腦發育尤其重要的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期生長和形態發育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關重要的作用［10］。多種神經性疾病都可能與 Wnt信號通路的異常有關［11］。通路上的β-catenin作為一種黏附因子，功能主要為介導細胞間黏附和參與基因的表達，在通路中處于關鍵地位。位于信號通路 β-catenin上游的GSK-3β是一個主要復興調節因子，阻止其下游的 βcatenin降解，使神經元增值過快、數量增加，導致神經元形成錯誤的聯系［12］，從而使自閉癥患者表現出社會交往障礙、刻板行為模式及情緒焦慮等方面的異常［12］。本實驗通過針刺干預自閉癥模型大鼠后，其長強穴治療組在水迷宮試驗中其定位航行試驗逃避潛伏期所用的時間明顯縮短，表明針刺長強穴后自閉癥模型大鼠的學習記憶能力有所提高；其海馬區 Wnt通路上的 β-catenin表達下調、GSK-3β表達上調，從而使亢進的Wnt通路趨于正常。這些指標提示從腦內在結構到外在行為表現都說明針刺長強穴對自閉癥模型大鼠具有治療作用。觀察這兩個信號蛋白在大鼠腦內海馬區的蛋白表達與細胞形態的變化，以希望認識到這些變化與學習記憶功能改善之間的相關性，但其具體作用機制尚不明了，有待進一步研究其相關性。