不同光照條件下氮濃度對衣藻生長及油脂積累的影響

陳余佳, 涂曉盟, 王永強, 王全喜, 許麗麗

(上海師范大學 生命科學學院 植物種質資源開發協同創新中心,上海 200234)

0 引 言

傳統化工能源在生產過程中會產生含硫及含氮污染物,新能源的開發利用已成為一項迫切的任務[1].在生產過程中,生物質能源通過光合作用將空氣中的二氧化碳轉化成有機物儲存,其在燃燒時又把二氧化碳再次釋放到大氣中,因此被認為是一種新型的低排放、低污染的清潔能源[2].藻類可以通過光合作用將二氧化碳和水轉化為氧氣、碳水化合物或者脂質形式的大分子有機物[3].在某些脅迫條件下,如高光或營養缺乏,一些藻類可積累大量脂質,如三酰甘油酯等[4-5].由于微藻生長速度快,脂質含量高,又被認為是生產生物柴油的理想材料[4-5].目前發現產油量高的藻類主要包括金藻(Chrysophytes)、定鞭藻(Haptophytes)、雙鞭毛蟲(Dinophytes)、黃藻(Xanthophyceae)、紅藻(Rhodophytes)和萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)等.它們在正常環境下生長時的平均油脂質量分數為干重的27.1%,處于環境脅迫條件下時則可上升到44.6%[4].相比其他藻類,萊茵衣藻(以下簡稱衣藻)是一種單細胞綠藻,其基因組已被完全測序,便于進行遺傳研究,且生長快,培養成本低,在缺氮條件下能產生油脂,被認為是油脂生產研究的模式物種[6].與其他微藻類一樣,衣藻在缺氮條件下的生長受到抑制,其生物量與油脂的積累及缺氮程度呈負相關[6-8],這導致其脂質生產效率及積累量均低于理論值.因此,探明衣藻油脂積累的最佳條件,是當前藻類產油的研究熱點.本研究設置不同氮含量的培養基,在不同光照條件下進行衣藻產油誘導,并測定衣藻的生物量及油脂含量,以確定最適于衣藻油脂積累環境的氮含量.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與培養方法

選用的衣藻藻種為衣藻(C.reinhardtii)cc849,購自美國杜克大學藻種庫,其正常培養條件為:溫度 (25±1) ℃,水平搖床轉速 120 r·min-1,光照強度 0～200 μE·m-2·s-1,培養基為Tris-Acetate-Phosphate(TAP) (pH=7.0),液體培養每5 d繼代1次,接種量為1%;固體TAP培養基含1%(質量分數)的瓊脂,藻種的純化和保存是以藻液或單克隆通過劃線方法接種在TAP瓊脂平板上,每二周繼代1次[9].用相等物質的量的氯化鈉替換正常TAP培養基內的氯化銨來配制缺氮培養基(TAP-N)以培養衣藻產油[9-10].

1.2 衣藻的缺氮培養

當培養瓶中的衣藻細胞生長到對數期(約2～3 d)時,在25℃溫度下,以3500 r·min-1轉速離心5 min,棄上清,使用TAP-N培養基緩慢洗滌藻細胞3次,以徹底除去氮[8].用TAP-N培養基洗滌過的衣藻,按照體積分數1%接種量加入到容積為500 mL的培養瓶中.然后用TAP-N培養基及TAP培養基定容混合培養液400 mL,使得培養基中氮的質量濃度分別為100,200,300 mg·mL-1,輕輕晃動培養瓶中的樣品,使藻類懸浮均勻.用TAP-N培養基及正常TAP培養基培養的衣藻樣品作為實驗對照組.最后將培養瓶分別置于光照強度為30,60,100,200 μE·m-2·s-1的光照條件下進行缺氮培養.

1.3 衣藻生長的測定

衣藻在750 nm處的吸光度(OD750)值與其細胞數正相關,因此可用分光光度計測定衣藻的OD750值來反映衣藻的生長情況[10].所用分光光度計為TU-1901雙光束可見-紫外光分光光度計(北京普析通用有限責任公司).衣藻葉綠素含量的測定是用95%(體積分數)酒精萃取,測定OD665值(A665)和OD649值(A649),計算出衣藻中的葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)及總葉綠素(Chl)的質量濃度(CChla,CChlb,CCh1)(單位為mg·L-1),計算公式[10]為:

CChl=CChla+CChlb= 6.10×A665+ 20.04×A649,

(1)

并進行3次生物學重復,取平均值.

1.4 衣藻油脂的測定

采用文獻[11]的方法檢測衣藻中的油脂含量,并進行3次生物學重復.提取400 mL藻細胞,以3500 r·min-1轉速離心10 min,然后用新鮮的TAP-N培養基洗滌3次,之后將固體樣品放入干燥的稱量瓶中在溫度80 ℃的烘箱中干燥24 h,直到質量不再減少為止.稱取0.2 g的干細胞(質量記為W0),將其轉移到離心管中,然后將5 mL的氯仿和甲醇的混合物(體積比為1∶1)加入到離心管中.將離心管中的細胞和混合物在振蕩器上震蕩30 min,然后以5000 r·min-1轉速離心10 min,取上清液.重復以上步驟直到萃取的上清液為無色.收集所有上清液(質量記為W1),并轉移至質量已知的干燥旋轉蒸發儀中蒸發至干燥(質量記為W2).總脂含量(質量分數)

Ct= (W2-W1)/W0×100%.

(2)

1.5 數據分析

采用獨立樣本t檢驗,分析實驗組和對照組的油脂產量的差異,顯著性水平設定為p<0.05.顯著性差異的結果用*標注在相應的圖中.同時本文作者采用雙因素方差分析探索了光照、氮,以及光照和氮的交互作用對油脂產量的影響.所有數據處理過程均在SPSS 19.0中完成.

2 結果與分析

2.1 氮濃度對衣藻生長的影響

以TAP-N培養基及正常TAP培養基作為實驗對照組,對不同氮濃度脅迫下的衣藻在不同光照強度下的油脂產量進行檢測,結果如圖1所示.

當光照強度為30 μE·m-2·s-1,培養基中氮的質量濃度分別為0 (TAP-N),100,200,300和375 mg·L-1(TAP培養基)時,衣藻的OD750值隨著培養時間增加逐漸增長,至第7 d時達到最大值,分別為0.08,1.61,1.61,1.62和1.75,如圖1(a)所示;衣藻的葉綠素質量濃度也隨著培養時間增加逐漸增長,最初為0.35 mg·mL-1,至第7 d時達到最大值,分別為0.04,7.08,17.87,26.01,27.84 mg·mL-1,如圖1(b)所示.相對于TAP培養基中的衣藻,缺氮條件下衣藻的生長受到了抑制,尤其在完全缺氮(TAP-N)條件下,本研究結果顯示:在第7 d,衣藻的生長受到明顯的抑制,OD750值比TAP條件下的降低了97.3%,葉綠素質量濃度降低了99.8%.當培養基中氮的質量濃度為100,200,300 mg·L-1時,所培養衣藻的OD750值分別比TAP條件下的值降低了45.8%,45.8%和45.5%.葉綠素的質量濃度下降更為顯著,分別比TAP條件下的值降低了74.6%、35.8%和6.6%.其他培養時間均有類似的趨勢,但是抑制效果沒有第7 d的明顯.

同30 μE·m-2·s-1類似,當光照強度為60 μE·m-2·s-1和100 μE·m-2·s-1條件時,衣藻的OD750值和葉綠素質量濃度也隨著培養時間增加逐漸增長,如圖1(c)～1(f)所示.在完全缺氮條件下,在第7 d時分別達到最大值,OD750值分別為2.96和3.01,如圖1(c),1(e)所示;葉綠素質量濃度最大值分別為29.26 mg·mL-1和28.88 mg·mL-1,如圖1(d),1(f)所示.由結果可知,在光照強度為60 μE·m-2·s-1和100 μE·m-2·s-1時,缺氮后的衣藻生長都同樣受到了影響,尤其是TAP-N條件下,衣藻的OD750值比對照組TAP條件下的值降低了92.9%～97.0%,葉綠素濃度降低了98.8%～99.4%.其他培養時間均有類似的趨勢,但是抑制效果沒有第7 d的明顯.

圖1 不同氮質量濃度下,衣藻OD750值與葉綠素質量濃度隨時間增長的變化.光照強度為(a),(b)30 μE·m-2·s-1;(c),(d) 60 μE·m-2·s-1;(e),(f) 100 μE·m-2·s-1

2.2 氮濃度對衣藻油脂積累的影響

由圖1可知,盡管氮濃度及光照強度條件不同,但衣藻的生長在第2 d基本處于對數增長時期.因此,為了統一培養時間,本文作者檢測了衣藻在不同光照強度及氮濃度條件下培養至第2 d的油脂含量,結果如圖2,表1所示.由圖2可知,缺氮脅迫可以促進衣藻體內油脂的積累,氮濃度越低衣藻的總脂含量越高,在3個光照強度下,完全缺氮條件(0 mg·L-1,TAP-N)下衣藻的總脂含量最大,顯著高于氮質量濃度為100,200,300,375 mg·L-1時的(p<0.05).當光照強度為30 μE·m-2·s-1時,TAP-N培養基培養的衣藻的總脂含量(質量分數)為48.6%,大約是TAP培養條件下的3.2倍,其他氮濃度條件下衣藻的總脂含量大約分別是對照組TAP條件下的2.7,2.4和1.7倍.當光照強度為60 μE·m-2·s-1時,衣藻的油脂產量也隨著氮濃度的增多逐漸降低,尤其是完全缺氮的情況下總脂含量(質量分數)最高為42.2%,大約是對照組TAP條件下的3.2倍,其他氮濃度條件下的總脂含量大約分別是對照組條件下的2.5,1.8和1.4倍.同樣地,當光照強度為100 μE·m-2·s-1時,衣藻的總脂含量也隨著氮濃度的增多逐漸降低,完全缺氮的情況下總脂含量(質量分數)最高為39.2%,大約是對照組TAP條件下的3.3倍,其他氮濃度條件下的總脂含量大約分別是對照組TAP條件下的3.0,2.9和1.9倍.通過獨立樣本t檢驗進行顯著性差異分析可知,缺氮條件下培養的衣藻的總脂含量相比于TAP培養基中的衣藻的總脂含量均有顯著性提高(p<0.05).

圖2 不同光照強度及氮濃度條件下衣藻在第2 d的總脂含量.*表示通過獨立樣本t檢驗實驗組與對照組具有顯著性差異

表1 不同光照強度及氮濃度條件下衣藻在第2 d的總脂含量

2.3 衣藻油脂積累的影響因素分析

由圖1和表2可知,光照強度和氮質量濃度都能對衣藻的油脂積累量產生影響.利用雙因素方差分析了第2 d的數據.結果表明,光照強度、氮質量濃度及這2個因素的交互作用對總脂含量的影響都是顯著的(p<0.05).光照強度與油脂積累量成負關聯,油脂積累量隨氮質量濃度增加而減小(圖2,表1).這說明,光照強度為30 μE·m-2·s-1和低氮濃度條件下衣藻的總脂含量最優,在探究影響衣藻總脂含量時需同時考慮這兩個因素的作用.

表2中,df表示自由度;F為檢驗的數值;p為相應的影響因素對總酯含量影響的顯著性水平;R2為決定系數,表示雙因素方差分析整體可信程度,R2越高,表示雙因素方差分析的結果越可信.R2=0.98.

表2 光照強度和氮質量濃度對總脂含量影響的雙因素方差分析結果

3 討 論

自然條件下微藻體內的油脂含量相對比較低,但是在氮濃度不足的情況下,脂肪和碳水化合物產量會増加,因此大部分的微藻產油都是基于缺氮條件培養.SIAUT等[12]研究發現,衣藻的油脂積累量與其生物量有直接關系,同時也會受到光照強度、pH值等其他因素的影響[13].本研究設置了5個不同的氮濃度及3個不同的光照強度梯度以探究衣藻產油的適宜條件.實驗結果表明:缺氮條件下衣藻的生長受到抑制,尤其是葉綠素含量相對于正常TAP培養基中的衣藻受到嚴重抑制,由于氮元素是葉綠素的主要組成部分,因此缺氮后衣藻的葉綠素合成受到較大影響,可以進一步通過檢測衣藻的光系統二的活性來驗證.KIM等[13]指出:光照強度過大,衣藻細胞容易受到光損傷,而較低的光照強度下衣藻細胞的光合作用較弱,也不利于其生物量的積累,因此很有必要尋找衣藻生物量積累的適宜光照強度.本研究利用雙因素方差分析光照強度和氮濃度對衣藻油脂積累量的影響.結果發現,光照強度和氮濃度都對油脂積累具有重要作用.結合t檢驗對比分析結果發現,利于衣藻生物量積累的最佳光照強度為30 μE·m-2·s-1.同時,與HU等[14]和WANG等[15]的研究結果相同.本研究結果顯示衣藻在完全缺氮(TAP-N)狀態下的油脂含量增加最為顯著.但是考慮到生物量因素,選取最佳氮質量濃度為100 mg·mL-1為宜.當光照強度30 μE·m-2·s-1,氮質量濃度為100 mg·mL-1時,衣藻的油脂積累量取得最優值,為39.79%(表1).此外,由于本研究中設置的初始衣藻細胞濃度過低(OD750僅為0.34),導致了完全缺氮條件下衣藻的生物量極低,而氮濃度設置梯度過大,這導致較低水平的氮含量培養的衣藻生物量偏差太大.因此在今后的研究中,應提高衣藻的初始細胞濃度,并縮小氮濃度梯度間隔.

4 結 論

檢測了不同氮濃度下及光照強度下衣藻的油脂產量,結果顯示,氮濃度和光照強度都對衣藻油脂積累量存在顯著影響,利用衣藻產油時,需綜合考慮這兩個因素.本研究得出衣藻最佳積累油脂的氮質量濃度為100 mg·mL-1,光照強度為30 μE·m-2·s-1.