昆蟲體內微生物多樣性的影響因素研究進展

魏曉瑩， 郭晨亮， 褚 棟

青島農業大學植物醫學學院，山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東 青島266109

昆蟲是生物界中種類最豐富、數量最大的類群，對農業生產和人類健康具有重大影響。 昆蟲體內微生物通過直接的方式影響宿主的生物學(Crotti et al.，2012)。 微生物不僅能為宿主昆蟲提供營養物質、消化食物、解毒(Mason et al.，2014； Mattila et al.，2012； Warnecke et al.，2007)及提高免疫活性(Engel ＆ Moran，2013)等功能外，還影響宿主的生殖方式(Serbus et al.，2008)、適合度(褚棟等，2005；Guo et al.，2017； Skaljac et al.，2018)、運動行為(Schretter et al.，2018)及抗藥性(夏曉峰，2014；Cheng et al.，2017； Guo et al.，2017； Xia et al.，2013，2018)。 因此，體內微生物多樣性的研究對于了解宿主昆蟲的生物學具有重要意義。

許多微生物很難被傳統手段分離培養，因而對微生物多樣性的研究造成很大局限(Vaughan et al.，2000)，且環境樣品中只有1%左右可培養微生物(Amann et al.，1995)。 目前，針對昆蟲體內微生物多樣性的檢測方法除了傳統的鑒定方法(劉玉升等，2007)外，分子生物學方法已廣泛應用。 向候君等(2018)已對昆蟲內共生菌的各種鑒定方法進行了詳細論述，本文不再對此進行介紹。 本文在基于昆蟲體內微生物多樣性概況的基礎上重點介紹影響體內微生物多樣性的各種因素。

1 昆蟲體內微生物多樣性分析概況

目前，昆蟲體內微生物多樣性的研究多以腸道微生物多樣性的研究為主，主要集中于鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、半翅目、膜翅目、脈翅目和直翅目等昆蟲的腸道微生物。

1.1 優勢菌門

當前研究表明，昆蟲體內微生物的優勢菌門以變形菌門或/和厚壁菌門為主。 例如，鞘翅目的天牛Saperda vestita Say(Schloss et al.，2006)，鱗翅目的茶尺蠖Ectropis obliqua Prout (靳亮等，2013)和稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis (Guenée)(劉小改等，2016)，雙翅目的地中海實蠅Ceratitis capitata Wiedemann(Behar et al.，2008)、沙蠅Lutzomyia longipalpis (Lutz ＆ Neiva)(Sant′Anna et al.，2012)、柑橘大實蠅Bactrocera minax (Enderlein)(Wang et al.，2014) 和 澤 蘭 實 蠅Procecidochares utilis Stone(張某等，2016)，半翅目的豌豆蚜Acythosiphon pisum (Harris)、黑豆蚜Aphis fabae Scopoli(Haynes et al.，2003)和點蜂緣蝽象Riptortus clavatus Thunberg(Kikuchi et al.，2007)，直翅目的沙漠蝗Schistocerca gregaria (Forskal)(Dillon ＆ Charnley，2002)等昆蟲的腸道優勢菌門僅為變形菌門。 對半翅目的煙粉虱Bemisia tabaci Gennadius 隱種MEAM1 與MED(Lv et al.，2018； Su et al.，2016)、扶桑綿粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley(王震杰，2014)、小貫小綠葉蟬Empoasca onukii Matsuda(毛迎新等，2018)和脈翅目的中華通草蛉Chrysoperla sinica (Tjeder)(趙輝等，2017)等成蟲的整體分析，發現這些昆蟲體內的優勢菌門也僅為變形菌門。 此外，鞘翅目的五月鰓金龜Melolontha melolontha (L.) (Egert et al.，2005)，鱗翅目的豆天蛾Clanis bilineata tsingtauica Mell(呂飛和劉玉升，2009)等昆蟲的腸道優勢菌門僅為厚壁菌門。 然而，鞘翅目的暗黑鰓金龜Holotrichia parallela Motschulsky(Huang ＆ Zhang，2013)、膜翅目的中華蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius(張義強，2013)、鱗翅目的舞毒蛾Lymantria dispar (L.)(Broderick et al.，2004)、棉鈴蟲Helicoverpa armigera (Hübner)(Xiang et al.，2006)、小菜蛾Plutella xylostella L.(夏曉峰，2014)、貢嘎蝠蛾Hepialus gonggaensis (Fu et Huang)(劉莉等，2008)、櫟黃掌舟蛾Phalera assimilis (Bremer et Grey)(文竹等，2015)、馬鈴薯塊莖蛾Phthorimaea operculella(Zeller)(鄭亞強等，2017)和美國白蛾Hyphantria cunea Drury(魏丹峰等，2017)以及雙翅目的11 種果蠅Drosophila spp.(Wong et al.，2013)的腸道優勢菌都以變形菌門和厚壁菌門為主。

一些昆蟲腸道優勢菌門除了變形菌門或/和厚壁菌門外，還有其他優勢菌門，如放線菌門或/和擬桿菌門。 例如，鱗翅目的稻縱卷葉螟(劉小改等，2016)和棉鈴蟲(Ranjith et al.，2016)的腸道優勢菌門除變形菌門或/和厚壁菌門外，主要還有放線菌門；雙翅目的家蠅Musca domestica L.(Gupta et al.，2012)和南亞實蠅Bactrocera tau (Walker)(駱米娟，2016)、直翅目的蟋蟀Gryllidae(張科等，2017)等昆蟲的腸道優勢菌門除含有變形菌門和厚壁菌門外，主要還有擬桿菌門；鞘翅目的光肩星天牛Anoplophora glabripennis (Motschulsky)腸道優勢菌門除含有變形菌門和厚壁菌門外，還有放線菌門和擬桿菌門(Schloss et al.，2006)。

由上述可知，同一個目的昆蟲其體內微生物的優勢菌門也有可能不同。 例如：(1)鞘翅目的天牛、五月鰓金龜、暗黑鰓金龜和光肩星天牛，除五月鰓金龜的腸道優勢菌門只含有厚壁菌門外，其他3 種昆蟲的腸道優勢菌門都含有變形菌門，其中暗黑鰓金龜還含有厚壁菌門，光肩星天牛還含有厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門；(2)鱗翅目的豆天蛾、茶尺蠖、稻縱卷葉螟、舞毒蛾、棉鈴蟲、小菜蛾、貢嘎蝠蛾、櫟黃掌舟蛾、馬鈴薯塊莖蛾、美國白蛾、稻縱卷葉螟和棉鈴蟲，除豆天蛾的腸道優勢菌門只含有厚壁菌門外，其他11 種昆蟲的腸道優勢菌門都含有變形菌門，其中舞毒蛾、棉鈴蟲、小菜蛾、貢嘎蝠蛾、櫟黃掌舟蛾、馬鈴薯塊莖蛾、美國白蛾和棉鈴蟲這8種昆蟲的腸道優勢菌門除含有變形菌門外，還含有厚壁菌門，稻縱卷葉螟和棉鈴蟲還含有放線菌門；(3)雙翅目的地中海實蠅、沙蠅、柑橘大實蠅、澤蘭實蠅、家蠅和南亞實蠅，上述6 種昆蟲的腸道優勢菌門除都含有變形菌門外，家蠅和南亞實蠅還含有厚壁菌門和擬桿菌門；(4)直翅目的沙漠蝗和蟋蟀的腸道優勢菌門除都含有變形菌門外，蟋蟀還含有厚壁菌門和擬桿菌門。

1.2 優勢菌屬

同一目的昆蟲腸道優勢菌門相同時，其腸道優勢菌屬未必相同。 例如，雙翅目昆蟲中腸道優勢菌門為變形菌門的柑橘大實蠅、地中海實蠅和澤蘭實蠅，其中前2 種昆蟲的腸道中都含有克雷伯氏菌屬Klebsiella 和檸檬酸桿菌屬Citrobacter 2 個優勢菌屬，地中海實蠅還含有泛菌屬Pantoea、腸桿菌屬Enterobacter 和果膠桿菌屬Pectobacterium，而澤蘭實蠅與上述2 種昆蟲都不同，其腸道優勢菌屬是沃爾巴克氏體Wolbachia。 又如鱗翅目昆蟲腸道優勢菌門為厚壁菌門的貢嘎蝠蛾、豆天蛾和舞毒蛾，其中前2 種昆蟲的腸道中都含有芽孢桿菌屬Bacillus 1個優勢菌屬，貢嘎蝠蛾還含有肉食桿菌屬Carnobacterium，而豆天蛾腸道優勢菌屬還含有葡萄球菌屬Staphylococcus，而舞毒蛾與上述2 種昆蟲都不同，其腸道優勢菌屬則是腸球菌屬Enterococcus。

2 影響昆蟲體內微生物多樣性的因素

研究發現，昆蟲體內微生物多樣性主要受昆蟲性別、發育齡期和種群等方面的影響，另外食物、溫度、CO2濃度及輻照等生態因子以及研究手段的局限性等方面也會影響昆蟲體內微生物多樣性。

2.1 昆蟲性別、發育齡期及種群的影響

不同性別的昆蟲其體內微生物多樣性與豐度存在差異。 例如，家蠶Bombyx mori L.雌雄個體的腸道中除共有的優勢菌屬外，雄性腸道中特有的優勢菌屬是青枯菌屬Ralatonia、甲基桿菌屬Methylobacterium 和葡萄球菌屬；而雌性腸道中特有的優勢菌屬是佩特羅菌屬Petrobacter、狹義梭菌屬Clostridium sensu stricto；在雄性中有23 個菌屬的豐度是雌性的1.5 倍以上，而在雌性中有7 個菌屬的豐度是雄性的1.5 倍以上(許剛等，2015)。 中華通草蛉雌雄成蟲體內微生物多樣性也存在明顯差異，雌雄成蟲體內除了共有的優勢菌屬外，雄成蟲體內特有的優勢菌屬為檸檬酸桿菌屬、醋酸桿菌屬Acetobacter、朝井桿菌屬Asaia 和Rosenbergiella，而雌成蟲體內特有的優勢菌屬是Cosenzaea myxofaciens(趙輝等，2017)。

性別相同但顎型不同的昆蟲其腸道微生物多樣性也存在差異。 例如，3 種顎型(大、中、小)的華美奧鍬甲Odontolabis fallaciosa Boileau 的雄成蟲腸道微生物中除共有的優勢菌門外，中、小顎型宿主中還含有擬桿菌門，而大顎型宿主中的厚壁菌門含量顯著高于中、小顎型；3 種顎型的宿主其腸道微生物不僅優勢菌門存在差異，其優勢菌屬也存在差異，除共有的優勢菌屬外，大、小顎型宿主中還含有Dysgonomonas 屬，而中顎型宿主還含有巴爾通氏體屬Bartonella(蔣宇等，2018)。

除不同性別的昆蟲腸道微生物多樣性存在差異外，不同發育齡期的昆蟲腸道微生物多樣性與比例也存在差異。 如不同齡期的暗黑鰓金龜幼蟲腸道微生物多樣性存在差異，其1 齡幼蟲的優勢菌門擬桿菌門的豐度最高，而第2 和第3 齡幼蟲中厚壁菌門的豐度最高(Huang ＆ Zhang，2013)。 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)幼蟲腸道中的優勢菌屬不動桿菌屬Acinetobacter，其相對豐度隨宿主齡期的變化出現先下降后上升的趨勢，在第5 齡時其相對豐度最大；而噬氫菌屬Pelomonas 和噬酸菌屬Acidovorax 的相對豐度則隨著宿主的齡期變化呈現下降的趨勢(李文丹等，2018)。 岡比亞按蚊Anopheles gambiae Giles 在幼蟲和蛹期時其腸道優勢菌門為藍細菌門Cyanobacteria，而成蟲時其腸道優勢菌門則為變形菌門和擬桿菌門(Wang et al.，2011)。

發育齡期相同但生存環境不同的昆蟲其腸道微生物多樣性也存在差異。 如日本弓背蟻Camponotus japonicus Mayr 室內和野外巢群的卵、幼蟲和蛹的腸道微生物中除共有優勢菌門外，室內巢群的卵中含有泉古菌門Crenarchaeota 的火棒菌屬Pyrobaculum 細菌，而野外巢群的卵、幼蟲和蛹中含有放線菌門的鏈霉菌屬Streptomyces 和兩面神菌屬Janibacter 細菌；另外，室內巢群的蟻后中含有厚壁菌門的芽孢桿菌屬和魏斯氏菌屬Weissella 細菌，而野外巢群的蟻后中含有厚壁菌門Anoxybacillus 屬的細菌(朱卓琳，2015)。

不同地理種群的昆蟲其體內微生物多樣性與比例也存在差異。 如在10 個不同地理種群的暗黑鰓金龜幼蟲腸道中厚壁菌門中的瘤胃菌科Ruminococcaceae 和毛螺旋菌科Lachnospiraceae 以及變形菌門中的腸桿菌科Enterobacteriaceae 和脫硫弧菌科Desulfovibrionaceae 的細菌在10 個地理種群中分布和比例存在顯著差異(Huang ＆ Zhang，2013)。通過宏基因組測序首次發現不同地理種群的小貫小綠葉蟬成蟲體內共生菌的多樣性和比例存在差異，其中，赤壁、大悟和英山樣本的優勢菌屬均為鹽單胞菌屬Halomonas(相對豐度分別為23.8%、27.1%、8.8%)，武漢樣本的優勢菌屬為泛菌屬(相對豐度61.2%)，咸安樣本的優勢菌屬則為沃爾巴克氏體屬(相對豐度92.6%)(毛迎新等，2018)。

除上述因素影響宿主體內微生物多樣性外，不同海拔高度也會對昆蟲體內微生物多樣性有影響。例如，棲居于不同海拔高度的13 個中華蜜蜂Apis cerana Fab.種群腸道微生物多樣性存在差異，其中，高海拔種群的優勢菌屬為厚壁菌門中的芽孢桿菌屬，而平原和沿海種群的優勢菌屬為變形菌門中的沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬(Sudhagar et al.，2017)。

2.2 食物、溫度、CO2 濃度及輻照的影響

研究發現，食物對昆蟲體內微生物多樣性具有重要影響(Russell et al.，2009)。 舞毒蛾(Broderick et al.，2004)、棉鈴蟲(Priya et al.，2012； Xiang et al.，2006)、高山象白蟻Nasutitermes takasagoensis(Shiraki)(Miyata et al.，2007)、美國白蛾(魏丹峰等，2017)、蝴蝶Rhopalocera(Kruttika et al.，2017)、黑腹果蠅Drosophila melanogaster Meigen(Chandler et al.，2011)、擬果蠅Drosophila simulans(Staubach et al.，2013)、家蠶(相輝等，2007； 向蕓慶等，2010)以及岡比亞按蚊(Wang et al.，2011)等昆蟲中腸道相關細菌群落的變化與食物有關。 例如，家蠶分別用柘葉與桑葉飼養時，其幼蟲腸道中除共有的優勢菌屬外，用桑葉飼養的家蠶腸道中還含有氣單胞菌屬Aeromonas、檸檬酸桿菌屬、短桿菌屬Brevibacterium、埃希氏菌屬Escherichia 和克雷伯氏菌屬5 個優勢菌屬，而用柘葉飼養的家蠶腸道中僅含有假單胞菌屬和土壤桿菌屬Agrobacterium 2 個優勢菌屬(向蕓慶等，2010)。 然而，用無桑飼料飼養的家蠶幼蟲腸道中的優勢菌屬為腸球菌屬、棲熱菌屬Thermus 和葡萄球菌屬(相輝等，2007)。 以人工飼料為食的美國白蛾幼蟲腸道中的優勢菌屬為希瓦氏菌屬Shewanella 和腸球菌屬，其中腸球菌屬的豐度顯著高于以桑樹和柳樹為食的幼蟲，以桑樹為食的美國白蛾幼蟲腸道中的優勢菌屬為葡萄球菌屬，而以柳樹為食的美國白蛾幼蟲腸道中的優勢菌屬則為芽孢桿菌屬(魏丹峰等，2017)。

食物除了對咀嚼式口器昆蟲體內微生物多樣性有影響外，對刺吸式口器的昆蟲也有影響。 例如，煙粉虱(MED 隱種與MEAM1 隱種)分別取食棉花與健康番茄后，其體內細菌屬存在顯著差異；取食相同植物的煙粉虱(MED 隱種與MEAM1 隱種)其體內共生菌相似度較高(Su et al.，2016)。

溫度對昆蟲體內微生物多樣性也有影響。 家蠶經高溫(34 ℃)處理72 h 后，其腸道微生物的豐度顯著降低，雌蠶腸道微生物中的酸桿菌門Acidobacteria、擬桿菌門、放線菌門、梭桿菌門Fusobacteria 和芽單胞菌門Gemmatimonadetes 的豐度相較于對照組顯著降低，而雄蠶腸道微生物中僅酸桿菌門的豐度相較于對照組顯著降低(杜貝貝，2017)。

不同CO2濃度對昆蟲腸道微生物的豐度也具有影響。 棉鈴蟲進行3 種不同CO2濃度(380、550和750 μL·L-1)處理，腸桿菌屬在3 個處理間的豐度存在較大的差異，而普羅威登斯菌屬Providencia在380 μL·L-1CO2濃度下的豐度遠高于其他2 個處理下的豐度(劉金萍，2017)。

除上述因素對昆蟲體內微生物多樣性具有影響外，輻照對體內微生物多樣性也有影響。 對瓜實蠅Bactrocera cucurbitae (Coquillett)遺傳區性品系的8 日齡蛹進行100 Gy137Cs 輔照后發現，輻照組的成蟲腸道微生物多樣性和豐度顯著低于處理組，擬桿菌門僅在對照組的其中4 個樣品中出現(相對豐度比例分別為4%、16%、5.5%和17%)，而在輻照組的所有樣品中其相對豐度比例低于1%；優勢菌屬普羅威登斯菌屬在輻照組中的相對豐度比例顯著低于對照組(姚明燕等，2017)。

此外，研究表明，植物病毒對媒介昆蟲體內微生物無顯著影響。 例如，感染番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV)的寄主植物對煙粉虱(MED 隱種、MEAM1 隱種)相關細菌群落幾乎沒有影響(Su et al.，2016)。

2.3 研究手段的局限性

昆蟲DNA 的提取方法、技術手段(夏曉峰，2014)、引物的選擇以及數據庫(Su et al.，2016)等可能也會影響昆蟲體內微生物多樣性的分析。

昆蟲DNA 的提取方法可能會導致昆蟲體內微生物出現差異。 夏曉峰(2014)對小菜蛾腸道進行16S rRNA 基因V6 高變區和宏基因組測序時，分別使用不同試劑盒提取中腸細菌總DNA，宏基因組分析相較于16S rRNA 的研究結果相比，變形菌門的豐度升高，而厚壁菌門的豐度降低。

分子生物學技術的不同手段導致分析結果存在差異。 例如，夏曉峰(2014)基于16S rRNA 和宏基因組分析發現，2 種分析方法雖然都表明小菜蛾幼蟲中腸中變形菌門和厚壁菌門是豐度最高的2個門，但是宏基因組分析相較于16S rRNA 分析發現，變形菌門的豐度相對升高，而厚壁菌門的豐度降低。 原因可能是2 種分析方法在功能基因注釋上存在差異，也可能是因為16S rRNA V6 高變區的片段較短，在分類上也可能存在一定的誤差。

不同的研究手段中，使用的不同引物也可能是重要的影響因素。 16S rRNA 分析方法需要進行一次PCR 擴增，其引物的偏好性可能會導致某些細菌出現不同的豐度(夏曉峰，2014)。 基于16S rRNA V3-V4 高變區，使用341F 和805R 引物對煙粉虱MEAM1 隱種進行PCR 擴增，在其體內沒有發現次生共生菌Hamiltonella (Su et al.，2016)；而對煙粉虱MEAM1 隱種使用Ham-F 和Ham-R 引物進行普通PCR 檢測時，在其體內卻檢測到了次生共生菌Hamiltonella (Chiel et al.，2007； Chu et al.，2011)。 其他研究基于16S rRNA V4 高變區，使用515F 和806R 引物對煙粉虱MED 隱種進行PCR 擴增，在其體內也發現了次生共生菌Hamiltonella (Lv et al.，2018)。 這些結果提示，引物的偏好性可能導致某些細菌出現不同的豐度。

3 小結

綜上所述，體內微生物多樣性除了與昆蟲種類相關外，還與昆蟲自身因素(如性別、發育齡期以及不同地理種群)、生態因子(食物、溫度、CO2濃度及輻照等)密切相關；此外，技術本身的局限性也影響分析結果。 因此，在對昆蟲體內微生物多樣性研究中要注意上述因素。

當前，體內微生物多樣性的研究方興未艾。 相信今后隨著更加深入、全面的研究，越來越多的昆蟲體內微生物多樣性將會被人類進一步的挖掘和利用，這對于有益昆蟲的開發利用或有害昆蟲的治理具有重要的指導意義。