蛋白質羰基化及茶多酚的預防作用研究進展

左高隆，黃 霞，林 勇*，林海燕，陳美艷，劉仲華

（1.湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 資源環境學院，湖南 長沙 410128）

氧化應激會引起蛋白質發生可逆與不可逆修飾。其中，可逆修飾主要發生在半胱氨酸殘基上，且可通過特異性抗氧化酶進行修復[1]。而不可逆修飾如羰基化修飾則無法被體內的抗氧化防御機制修復[2]。因此，羰基化蛋白質會隨時間增加慢慢聚集，并引起多種信號通路改變和細胞功能障礙，最終導致細胞死亡[3]。蛋白質羰基化已被認為是機體氧化損傷的通用標志，且與各種疾病的發生與發展有關[4-5]。

機體雖無法修復羰基化蛋白質，但可利用各種抗氧化劑或抗氧化酶來抑制氧化應激過程從而減少羰基化蛋白質的形成，茶多酚便是一種優異的抗氧化劑。茶多酚是茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表兒茶素（EC）及其他約30種酚類化合物的總稱[6]，其抗氧化活性對于抑制蛋白質羰基化和防治相關疾病具有很好的效果。

1 蛋白質羰基化

1.1 羰基化蛋白質形成的原因和途徑

活性氧（ROS）被認為是有氧代謝的有毒副產物，并且是生物大分子損傷的主要原因[7]。體內的ROS 如自由基主要由線粒體電子傳遞鏈上的電子泄露產生[7]。泄漏的電子與氧氣結合后形成超氧化物陰離子自由基，并在錳、鐵超氧化物歧化酶的作用下被催化生成過氧化氫[8]。一部分過氧化氫與金屬離子發生芬頓反應生成羥基自由基[9]。膜磷脂和甘油三酯的不飽和側鏈在羥基自由基的作用下，形成脂質過氧化產物如4-羥基壬烯醛（4-HNE）[10]。隨后4-HNE與組氨酸、半胱氨酸和賴氨酸殘基側鏈發生邁克爾加成反應，對蛋白質進行共價修飾進而導致羰基化[11]。此外，羰基還可以通過α-酰胺化途徑或谷氨酰胺氧化途徑、賴氨酸殘基與活性羰基衍生物的二次反應和氨基酸殘基的金屬催化氧化反應產生[12-13]。

1.2 羰基化位點和羰基化蛋白質

由于羰基化位點是羰基化蛋白質功能改變或缺失的決定性因素，因此鑒定羰基化位點及其在蛋白質中的作用對于了解蛋白質羰基化過程和相關發病機理至關重要。最近一篇綜述報道了208種蛋白質中的456個非冗余位點，發現最容易被修飾的殘基是賴氨酸和脯氨酸，其次是精氨酸和蘇氨酸[14]。脯氨酸殘基的高羰基化程度可能因其存在于蛋白質二級結構的柔性環中，更容易與氧分子接觸。而蘇氨酸殘基由于擁有疏水側鏈，因此被埋藏在蛋白質中，不易被氧化[15]。另外蛋白質羰基化位點容易聚集，這種聚集趨勢可能由金屬結合位點引發，第一個氨基酸殘基被羰基化后會發生連鎖反應刺激其它位點進一步羰基化[16]。因此，羰基化位點與其在蛋白質中所處區域是否有金屬結合位點密切相關。蛋白質在亞細胞區室中的位置也是影響其遭受氧化損傷的因素之一。有報道顯示，44%的羰基化蛋白質來自線粒體，28%的來自細胞溶膠[17]，原因可能是因為線粒體是ROS 的主要來源。

1.3 羰基化蛋白質與疾病

羰基化蛋白質產生后由于無法被體內的抗氧化防御機制修復，因此會隨時間增長慢慢聚集，導致多種信號通路關鍵酶的功能改變或缺失，進而引發一系列與蛋白質羰基化有關的疾病。

1.3.1 炎癥

有科學家發現急性胰腺炎患者血漿中的羰基化蛋白質濃度顯著增加，并且與疾病的嚴重程度相關[18]。因此，血漿蛋白的羰基化似乎與炎癥的發展息息相關。另外，在接受通氣治療的早產兒的氣管吸出物中也觀察到羰基化蛋白質增加，并且羰基化蛋白質含量與髓過氧化物酶活性具有相關性[19]。

1.3.2 糖尿病

對糖尿病患者進行研究發現，年輕I 型糖尿病患者血漿中的羰基化蛋白質含量遠遠高于健康同齡人，而II 型糖尿病患者血漿羰基化蛋白質含量甚至更高[20]。并且有證據表明羰基化蛋白質的積累有助于糖尿病并發癥的發展，如動脈粥樣硬化、神經功能障礙以及視網膜病變[21-23]。

1.3.3 阿爾茨海默病

脂質過氧化衍生的羰基化產物如丙二醛的增加是阿爾茨海默病的一個特征[24]。在患有輕度認知障礙的人的大腦中也觀察到羰基化蛋白質含量升高，而這種情況通常在阿爾茨海默病發病前發生，這表明蛋白質羰基化可能是阿爾茨海默病發病和持續惡化的早期原因之一[25]。

2 茶多酚對蛋白質羰基化的預防作用

2.1 茶多酚的抗氧化能力及機制

2.1.1 直接清除體內自由基

茶多酚可以通過清除ROS 并產生更穩定的酚類自由基來減少氧化應激，其還可在氧化過程的早期階段通過降低黃嘌呤氧化酶活性來抑制ROS 的生成[6]。

2.1.2 預防脂質過氧化

ROS 與生物膜的多不飽和脂肪酸側鏈及核酸等生物大分子物質發生脂質過氧化反應形成脂質過氧化產物如丙二醛（MDA）和4-HNE，并引起細胞膜通透性和流動性改變，最終導致細胞結構和功能受損[10]。茶多酚不僅可以清除電子傳遞鏈上的氧自由基，還可以清除電子傳遞鏈反應的中間產物如脂質過氧化自由基和烷氧自由基，從而阻止自由基的擴增[26]。

2.1.3 螯合金屬離子

金屬離子是許多自由基產生過程中的催化劑，尤其是Fe2+，不僅能夠催化自由基的產生，還能夠介導脂質過氧化反應[9]。茶多酚能夠螯合金屬離子鐵和銅，從而防止金屬離子作為催化劑催化自由基的生成[27]。

2.1.4 增強機體的抗氧化能力

核因子Nrf 2 信號通路是目前發現抵御外源性刺激和有毒物質的核心轉錄因子。有研究表明，EGCG 通過抑制人骨髓間充質干細胞中P21的表達來激活Nrf 2 信號通路，以阻止由氧化應激誘導的細胞衰老[28]。并且我們推測PI3k 和蛋白激酶B 也可能參與了茶多酚對Nrf 2 抗氧化防御途徑的調節[29]。此外，綠茶多酚還可通過抑制核因子kB、細胞信號調節激酶和絲裂原活化蛋白激酶的活化來起抗氧化作用[30]。在H2N2誘導人真皮層纖維細胞損傷實驗中，EGCG 可通過增強超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX-px）活性以及降低MDA 水平來減少氧化損傷[26]。最后，EGCG 還通過與特異性受體如67KD 層粘連蛋白受體結合，使細胞內的第二信使如Ca2+增加，而這些信使能夠刺激如蛋白激酶B、一氧化氮合酶和酸性鞘磷脂等生物活性分子來抑制氧化應激[31]。

2.2 茶多酚抑制蛋白質羰基化作用及機制

當機體內抗氧化與氧化能力失衡后，會發生氧化應激反應，并導致蛋白質被羰基化。茶多酚的抗氧化能力能夠減少機體的氧化應激反應，其可通過多種途徑抑制蛋白質羰基化過程（圖1）。目前已有許多報道表明了茶多酚對蛋白質羰基化的抑制作用。

一是茶多酚可通過螯合金屬離子、抑制黃嘌呤氧化酶活性以及直接與體內ROS 結合來減少機體內產生的ROS，以此來抑制蛋白質羰基化。有報道表明，EGCG 可以通過螯合鐵離子來抑制蛋白質羰基化，并改善由1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導的神經缺陷[32]。

二是茶多酚可通過增強體內的抗氧化酶活性來抑制蛋白質羰基化。在體能恢復試驗中，兒茶素預處理能夠降低跑步后比目魚肌中的羰基化蛋白質含量，這可能是因為兒茶素的攝入使肌原纖維蛋白和抗氧化酶活性增加，并以此減少骨骼肌收縮功能障礙和肌肉萎縮[33]。GPX-px 是一種減少脂質過氧化物的重要酶，而脂質過氧化物與羰基化的形成密切相關。在氟化鈉的肝毒性實驗中，EGCG 可以防止由氟化鈉導致的肝臟羰基化蛋白含量增加[34]。同時，喂食綠茶兒茶素能夠降低老齡小鼠大腦中的羰基化蛋白質水平[35]。這可能是通過增強機體中GPX-px 的活性來達到抑制羰基化蛋白的作用。另一篇文獻也報道了服用綠茶兒茶素可以防止老年小鼠大腦海馬中SOD 和GPX-px 活性的下降并使羰基化蛋白質含量減少[36]。

三是茶多酚還可通過減少脂質過氧化終產物來抑制蛋白質羰基化。研究人員發現EGCG和綠茶水提取物均能夠在結腸生理模擬條件下猝滅4-HNE[37]。這可能是減少羰基化蛋白產生的原因之一。在用EGCG 給老齡大鼠灌胃30 d后，老齡大鼠的脂質過氧化水平和蛋白質羰基含量顯著降低[38]。此外，通過給老齡大鼠喂食富含多酚的綠茶提取物，在其心臟組織中同樣觀察到脂質過氧化，蛋白質羰基化被抑制以及GPX-px 活性的增加[39]。

3 總結與展望

蛋白質羰基化是否能夠成為疾病的致病原因，其中羰基化位點是至關重要的。只有在鑒定羰基化位點后，才能評估蛋白質羰基化對蛋白質功能的影響。因為蛋白質位點決定了蛋白質的功能，并且未來我們需要進一步闡明羰基化蛋白質豐度和羰基化的目標蛋白在疾病發生與發展中的重要作用?，F已發現蛋白質羰基修飾與多種健康疾病相關，如衰老、神經退行性疾病、癌癥和II 型糖尿病等。而茶多酚具備很強的抗氧化能力，它能夠通過多種途徑去抑制蛋白質羰基化過程，這為防治蛋白質羰基化相關疾病提供了可能。隨著對茶多酚預防蛋白質羰基化過程的繼續深入研究，并最終運用于臨床試驗，將一定能為蛋白質羰基化疾病的治療和茶葉保健功能的開發利用提供理論支撐。