熒光光譜法研究檸檬黃與溶菌酶的相互作用

(衡水學院 化工學院，河北 衡水 053000)

檸檬黃是一種具有水溶性的合成色素，大量用于糕點、膨化食品、飲料、糖果、藥品的著色。食用合成色素在人身體內的運載、分布及生理上的毒性與溶菌酶蛋白質的結合緊密相關，因此研究食用合成色素與溶菌酶的結合具有重要的意義。溶菌酶與藥物的相互作用方面的文獻報道很多[1-3]， 但研究溶菌酶與食用合成色素結合相互作用的報道則較少。

本文主要采用熒光光譜法探討了檸檬黃與溶菌酶之間的相互作用，探討了檸檬黃與溶菌酶兩者之間相互作用的猝滅機理，并考查了檸檬黃與溶菌酶兩者相互作用的結合常數、結合位點數和結合熱力學參數，還通過三維熒光光譜探討了檸檬黃對溶菌酶結構的影響以及溶菌酶構象變化的具體信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器： FA2204B電子天平(上海精密科學儀器股份有限公司)；水浴鍋；日立F-7000熒光分析儀；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計。

試劑：檸檬黃(天津多福源實業有限公司)；二次蒸餾水；溶菌酶(上海伯奧生物科技有限公司)。

溶菌酶標準儲備溶液：2×10-5mol·L-1，檸檬黃標準溶液：1×10-4mol·L-1。本實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜分析

分別向10支比色管中移取1.0×10-4mol/L的檸檬黃標準溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0mL再分別加入2×10-4mol/L溶菌酶標準溶液1mL，再向比色管中加入二次蒸餾水定容，配制成檸檬黃-溶菌酶體系溶液，配制3組，每組10支比色管，對每組在水浴鍋水浴加熱10min使溫度穩定至291℃、306℃和323℃。將檸檬黃-溶菌酶體系溶液分別置于比色皿中，設置激發波長為280 nm、熒光分光光度計的激發狹縫寬度和發射狹縫寬度均為5.0 nm，在300～450nm波長范圍內進行三種不同溫度熒光光譜掃描，測定不同溫度不同濃度的檸檬黃的檸檬黃-溶菌酶體系溶液的熒光強度。

1.2.2 同步熒光光譜分析

室溫下，分別移取1.0×10-4mol/L的檸檬黃標準溶液0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60mL于6支比色管中，再分別加入2×10-5mol/L溶菌酶標準溶液1mL，再向比色管中加入二次蒸餾水定容，配制成檸檬黃濃度不同的檸檬黃-溶菌酶體系溶液，移至1 mL比色皿中，于日立F-7000熒光分析儀上，分別掃描激發285nm、發射300nm和激發285nm、發射345nm下的該體系溶液的在300～450 nm波長范圍內進行掃描。

1.2.3 三維熒光光譜分析

室溫下，分別向兩支10mL比色管中移取1.0×10-4mol/L的檸檬黃標準溶液0mL和0.40mL和2×10-5mol/L溶菌酶標準溶液1mL，再向比色管中加入二次蒸餾水定容，配制成檸檬黃-溶菌酶體系溶液。將上述兩種溶液分別于激發狹縫寬度和發射狹縫寬度為5.0 nm，激發波長為275 nm、發射波長為340 nm進行光譜掃描，對溶液于一定波長范圍內進行熒光光譜的掃描，測定溶液熒光強度。

2 結果與討論

2.1 檸檬黃-溶菌酶體系的猝滅機理

2.1.1 熒光光譜

檸檬黃-溶菌酶體系的熒光光譜，結果見圖1。

圖1 檸檬黃濃度對溶菌酶熒光強度的影響

熒光猝滅通常按照Ksv與溫度的數學函數關系劃為靜態猝滅和動態猝滅兩種，如果兩者之間成反比，則屬于靜態猝滅，反之，則屬于動態猝滅。我們可以將不同溫度下的熒光光譜圖按Stern-Volmer方程(1)處理得到圖2。

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中：F0、F分別為加入檸檬黃前后溶菌酶的熒光強度；Ksv為猝滅常數，L·mol-1；[Q]為檸檬黃的濃度，mol-1·L；Kq是速率常數，L·mol-1·s-1；τ0為無猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命，s。

圖2 不同溫度時檸檬黃對溶菌酶的熒光猝滅Stern-Volmer曲線

根據曲線的斜率能求出在291K、306K、323K溫度下時的動態猝滅常數Ksv分別為分別為7.15×104，5.59×104，5.25×104L·mol-1。通過查閱文獻可以得知蛋白質的熒光壽命τ0為10-1s，所以根據方程(1)可以得到猝滅過程的速率常數Kq分別為7.15×1012，5.59×1012，5.25×1012L·mol-1。試驗結果中相關系數分別為0.9983，0.9938，0.9995，說明曲線呈線性，而且隨著溫度的增高，曲線的斜率降低，說明只存在一種猝滅方式。各種猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數約為2.0×1010L·mol-1·S-1，而根據方程(1)得到猝滅常數遠大于2.0×1010L·mol-1·S-1，因此判斷檸檬黃對溶菌酶的猝滅過程屬于靜態猝滅。

2.1.2 檸檬黃與溶菌酶的結合常數

靜態猝滅的結合常數和結合位點數可以通過方程(2)[4]處理得到圖3。

lg[(F0-F)/F] =lgKA+nlg[Q]

(2)

式中：F0、F分別為加入檸檬黃前后溶菌酶的熒光強度；K為結合常數，L·mol-1；n為結合位點數；[Q]為檸檬黃的濃度，mol-1·L；結果見表1。在不同的溫度體系下結合常數K的103，說明兩者之間的結合作用較大。

圖3 不同溫度下檸檬黃對溶菌酶熒光猝滅的雙對數圖

2.1.3 熱力學參數和作用力類型

檸檬黃與溶菌酶反應過程中的自由能變以及焓變和熵變可以根據根據公式(3)～(5)[55]求得，計算結果詳見表1。

ΔrGm=-RTlnKA

(3)

ΔrHm=T1T2/(T2-T1)Rln(KA2/KA1)

(4)

ΔrGm =ΔrHm-TΔrSm

(5)

式中△S為熵變，kJ·mol-1·K-1；△G為自由能變，kJ·mol-1；△H為焓變，kJ·mol-1；KA為結合常數，L·mol-1。由表1可知，三個△G均小于零，說明檸檬黃和溶菌酶之間的相互作用是自發進行的，兩者之間的主要結合力為范德華力和氫鍵。

表1 檸檬黃與溶菌酶之間的熱力學參數

2.2 檸檬黃-溶菌酶體系的同步熒光光譜

分別將測定條件中的Δλ設定為15和60nm，掃描即可得到溶菌酶在加入檸檬黃前后酪氨酸和色氨酸殘基的同步熒光特征光譜[6]，結果見圖4。

圖4 檸檬黃濃度對溶菌酶同步熒光光譜的影響

通過分析同步熒光光譜圖可知，熒光強度隨著檸檬黃濃度的增加而降低，溶菌酶的峰形基本不變，檸檬黃的引入對體系周圍環境的極性有些改變，而且酪氨酸殘基的熒光降低比色氨酸殘基更顯著，說明主要是酪氨酸殘基發生猝滅。

2.3 檸檬黃-溶菌酶體系的三維熒光光譜

實驗考查溶菌酶加入檸檬黃前后的三維熒光光譜，其中(λex/λem=275nm/340nm)為溶菌酶的特征峰見圖5。由圖5說明：加入檸檬黃后，溶菌酶的熒光強度大幅度降低，說明檸檬黃對溶菌酶的猝滅很大，兩者發生了相互作用。特征發射峰不發生變化，說明加入檸檬黃之后沒有改變溶菌酶所處的空間，不引起構象變化。

圖5 檸檬黃濃度對溶菌酶三維熒光光譜的影響

4 結論

本次實驗主要對檸檬黃與溶菌酶的相互作用采用熒光光譜法進行了研究，通過對兩者的光譜圖進行了分析，分析表示檸檬黃對溶菌酶具有熒光猝滅特性，主要模式為靜態猝滅；通過對檸檬黃與溶菌酶的相互作用光譜進行了分析，得知檸檬黃的加入使得溶菌酶的空間結構不穩定，構象發生了變化；通過熱力學參數焓變和熵變得出檸檬黃與溶菌酶的主要作用是靜電引力。