自發性糖尿病大鼠的抑郁癥行為與鈣網織蛋白前體、原肌球蛋白1、細胞分裂素活化蛋白激酶1和活化分裂素蛋白激酶1 表達的關聯

丁迎 馬計 方麗潔 肖娟 張競文 鄧玉潔

1武漢市武東醫院（武漢市第二精神病醫院）康復科（武漢430084）；2湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院內分泌科（湖北襄陽441021）；3澳門城市大學心理分析研究院（澳門999078）

抑郁癥是一種情感性精神障礙疾病，患者的主要臨床表現包括持久的心境低落且思維與行為異常，患者往往出現抑郁、自卑、情緒低落等悲觀心境狀態，部分患者存在自殺傾向及行為，近年來，抑郁癥的發病率呈逐年攀升的趨勢。抑郁癥的發病機制較為復雜，由于神經退行性病變的重要病理基礎之一即為海馬神經元凋亡，為此研究人員推斷海馬神經細胞的凋亡可能與抑郁癥的發病相關［1-3］。流行病學數據表明，至少有三分之一的糖尿病患者會出現相關抑郁障礙，而抑郁癥患者發生糖尿病的風險會增加37%。近日，第52 屆歐洲糖尿病研究協會（EASD）年會上公布的一項全球研究數據顯示，中國2 型糖尿病患者抑郁癥發生率為10.8%。CUMS 是一種經典的抑郁癥模型制作方案，該方案已經得到了國內外的高度認可，此模型能夠通過對抑郁癥的環境誘因進行模擬，從而產生抑郁癥的主要臨床表現及其引發的腦代謝變化。鈣網織蛋白前體（calreticulin precursor）、原肌球蛋白1（tropomyosin l）、細胞分裂素活化蛋白激酶1（milogen activated prolein kinase l）以及雙重特異性的活化分裂素蛋白激酶1（dual specificity mitogen-activated protein kinase l）是4 種與神經發生相關的蛋白，已有研究指出上述4 種蛋白在抑郁癥大鼠海馬組織中含量顯著下調。本研究的創新點是探討抑郁癥大鼠的抑郁行為與神經發生相關蛋白之間的相關性，以為臨床診治提供理論研究和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 本研究以20 只成年雄性健康大鼠（對照組）、40 只自發性糖尿病大鼠為研究對象，采用隨機數字法將40 例自發性糖尿病大鼠分為糖尿病組與糖尿病抑郁組，糖尿病抑郁組受試大鼠構建抑郁模型，每只大鼠單籠喂養，溫度22～24℃，相對濕度60%，自然光照，保持良好通風通風。

1.2 研究方法

1.2.1 CUMS 法構建抑郁大鼠模型［4］糖尿病抑郁組受試大鼠進行下列7 種刺激：夾尾1 min、熱烘5 min、4 ℃冰水游泳5 min、水平振蕩30 min、禁水24 h、禁食24 h、晝夜顛倒。夾尾指將大鼠置于固定籠內，將尾部露出，采用止血鉗在距尾根1 cm 處夾住并持續1 min；熱烘指將大鼠置于45 ℃恒溫水浴箱內5 min；冰水游泳指將大鼠置于裝有約15 cm 高的4 ℃冰水桶內5 min；振蕩指將大鼠置于160 次∕min 的告訴振蕩器內30 min；禁水指大鼠7：00am 次日7：00am 的24 h 期間不喂水；禁食指大鼠7：00am 次日7：00am 的24 h 期間不喂食；晝夜顛倒指將大鼠于7：00a.m。置于內面漆黑且不透光的黑暗狀態，至7：00p.m 時日光燈使其處于光照條件下直到次日7：00a.m。上述刺激每日進行1種，且每2 種刺激不可連續出現，共計3 周，具體安排如下：禁水，第1、8、15、22日；熱烘，第2、9、16日；禁食，第3、10、17日；晝夜顛倒，第4、11、18日；冰水游泳，第5、12、19日；振蕩，第6、13、20日；夾尾，第7、14、21日。

1.2.2 蔗糖水消耗試驗、曠野試驗測定大鼠抑郁行為 （1）蔗糖水消耗試驗：兩組受試大鼠于禁水次日，測定其1%蔗糖溶液的飲用量。（2）曠野試驗：造模結束后對受試大鼠進行曠野試驗，記錄其運動情況。實驗敞箱為長、寬、高分別為80 cm、80 cm、40 cm 的立柱體，內空、周壁為黑色，用黑線將地面劃分成等面積（16 cm×16 cm）的25 塊。將大鼠置于中心方格內，水平活動得分指大鼠穿越地面方塊的數量，垂直活動指大鼠的直立次數，每只受試大鼠僅測定1 次，每次3 min，在安靜的條件下于早7：30 至中午12：00 時間段內進行測定。

1.2.3 受試大鼠海馬組織中蛋白表達水平測定 海馬組織的制備，采用銳利的剪刀對大鼠進行快速斷頭，采用提前預冷（4 ℃）生理鹽水對腦組織血液進行沖洗，將多余肌肉減掉，以十字形剪開顱底，采用血管鉗將顱骨分離后在保證腦組織完整的前提下將其取下；采用眼科鑷對海馬表面的腦組織與筋膜進行徹底剝離；將眼科鑷凹面向上，向兩側輕輕完撐開，將海馬取下，稱重并記錄，置于凍存管中密封后保存在液氮中。采用Western法測定海馬組織中鈣網織蛋白前體、原肌球蛋白1、細胞分裂素活化蛋白激酶1 以及雙重特異性的活化分裂素蛋白激酶1 4 種蛋白表達水平，兔抗大鼠鈣網織蛋白前體多克隆抗體、兔抗大鼠原肌球蛋白1 多克隆抗體、兔抗大鼠細胞分裂素活化蛋白激酶1 多克隆抗體、兔抗人活化分裂素蛋白激酶1 多克隆抗體購自上海撫生實業有限公司，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學方法 本研究采用SPSS 20.0統計分析軟件（美國IBM 公司）進行處理；計量資料采用“均數±標準差”表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P＜0.05代表差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 3組受試大鼠應激第1、8、15日飲用蔗糖水量比較 應激第1、8日，3 組受試大鼠飲用蔗糖水量不存在顯著差異（P＞0.05）；應激第15、22日，糖尿病抑郁組受試大鼠飲用蔗糖水量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統計學意義（P＜0.05），對照組與糖尿病組受試大鼠飲用蔗糖水量不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖1。

圖1 3 組受試大鼠應激第1、8、15日飲用蔗糖水量比較Fig.1 Comparison of the rats in drinking water for first，eighth，fifteenth days under stress

2.2 3組受試大鼠曠野試驗水平、垂直得分比較 糖尿病抑郁組受試大鼠曠野試驗水平得分、垂直得分均明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠大曠野試驗水平得分、垂直得分不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖2。

2.3 3組受試大鼠鈣網織蛋白前體表達水平比較 糖尿病抑郁組受試大鼠鈣網織蛋白前體表達量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠鈣網織蛋白前體表達水平不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

2.4 3組受試大鼠原肌球蛋白1表達水平比較 糖尿病抑郁組受試大鼠原肌球蛋白1 表達量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠原肌球蛋白1表達水平不存在顯著差異（P ＞0.05）。見圖4。

2.5 3組受試大鼠細胞分裂素活化蛋白激酶1 表達水平比較 糖尿病抑郁組受試大鼠細胞分裂素活化蛋白激酶1 表達量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠細胞分裂素活化蛋白激酶1 表達水平不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖5。

2.6 3組受試大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表達水平比較 糖尿病抑郁組受試大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表達量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表達水平不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖6。

圖2 3 組受試大鼠曠野試驗水平、垂直得分比較Fig.2 Comparison of field test and vertical score between the rats

圖3 受試大鼠鈣網織蛋白前體表達水平比較Fig.3 Comparison of expression levels of calreticulin precursor in the rats

圖4 受試大鼠原肌球蛋白1 表達水平比較Fig.4 Comparison of tropomyosin 1 expression in the rats

圖5 3 組受試大鼠細胞分裂素活化蛋白激酶1 表達水平比較Fig.5 Comparison of the expression levels of cytokinin kinase 1 in three groups of rats

3 討論

當前的研究指出，糖尿病和抑郁癥兩者共病導致臨床結局變得更差。同時患有糖尿病和抑郁癥這兩種疾病的患者出現疾病相關并發癥的可能性，比只患其中一種疾病的患者高出2 倍。因為另一種疾病的存在，導致兩種疾病的預后都變得更差，包括疾病的嚴重程度，治療抵抗率和病死率增加，個體和社會的治療花費明顯上升，生存質量和糖尿病自我管理能力下降，并發癥發生率提高，以及預期壽命減少。

圖6 3 組受試大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表達水平比較Fig.6 Comparison of expression levels of activin splice kinase 1 in three groups of rats

抑郁癥是由多基因、多因素等共同導致的疾病，目前尚未發現單一的抑郁癥致病基因以及固定的遺傳模式［5-6］。近年來，隨著對抑郁癥研究的不斷深入，研究人員已經發現多種抑郁癥易感基因，然而部分基因所編碼的蛋白產物的作用尚未明確。當前蛋白質組的三大研究熱點包括腦蛋白組、血液蛋白質組以及肝臟蛋白質組，上述也領域是國內外研究的難點于薄弱環節。由于蛋白質具有翻譯調控以及翻譯后修飾等功能，蛋白組學可對轉錄組學以及基因組學的缺陷進行有效彌補，相對于基因組學來說，蛋白組學能夠提供更多的信息，并可對基因功能進行直接揭示。蛋白質作為基因的最終編碼產物以及藥物的直接作用靶點，其相關研究對抑郁癥等多種疾病的早期診斷、治療以及預后評估方面意義重大，“抑郁蛋白”有望開啟抑郁癥治療的新思路［7-10］。

研究顯示，在抑郁癥的發病機制的發生發展過程中海馬扮演著重要角色［11］。MRI 及尸檢結果均已顯示，抑郁癥患者的海馬體積相對較??；研究人員通過動物試驗發現，抑郁動物的糖皮質激素水平上升，能夠通過使得神經營養因子水平降低，最終發揮興奮性毒性作用，引起海馬神經發生降低。此外，另有研究證實，大鼠海馬神經發生可與抗抑郁藥物治療后出現增加，以X 線對藥物誘導的神經發生進行阻斷后，動物的抑郁行為會隨之復發。上述結論均表明，抗抑郁藥物改變抑郁行為通過對海馬的神經發生進行刺激以實現的，但目前仍尚未明確抑郁癥的致病以及抗抑郁藥物作用過程相關的蛋白包括哪些。

研究人員為健康大鼠應用抗抑郁藥物氟西汀并對其海馬蛋白組學進行分析，發現用藥后大鼠神經發生相關蛋白表達發生顯著變化。鈣網織蛋白前體與神經發生相關，屬于生長發育調節蛋白之一與蛋白合成及維護、腫瘤細胞的生長及侵襲等過程相關；細胞分裂素活化蛋白激酶參與神經系統的發育過程中的神經發生及神經分化，研究表明細胞分裂素活化蛋白激酶與神經炎癥過程中軸突運輸以及構建神經微絲相關，其水平異?？赡軙斐缮窠涀冃?，研究發現其在家族性多發性神經病患者體內表達水平降低［12-14］。原肌球蛋白1 表達水平異常與非小細胞肺癌、膀胱移行細胞癌等疾病相關［15］。本研究通過構建自發性糖尿病抑郁大鼠的UCMS 模型，經測定發現糖尿病抑郁組受試大鼠曠野試驗水平得分、垂直得分均明顯低于對照組及糖尿病組，提示抑郁模型構建成功；采用ELISA 法測定上述4 種蛋白表達水平發現，自發性糖尿病抑郁大鼠海馬組織中鈣網織蛋白前體、原肌球蛋白1、細胞分裂素活化蛋白激酶1 和活化分裂素蛋白激酶1 表達量均明顯低于健康大鼠及糖尿病大鼠，提示大鼠抑郁行為與上述4 種蛋白表達水平降低有關。本研究的創新點是發現，可以通過神經發生相關蛋白反映抑郁癥的發病進展情況。本研究的不足之處是，雖然從本研究結論能夠推斷出海馬神經發生相關蛋白含量降低于抑郁癥的發病具有一定的相關性，但仍有其他因素可能與該癥的發病相關，如例糖皮質激素水平上升對大腦皮層、海馬以及皮層下區域產生直接毒性作用等［16-18］，這也是本課題組進一步的研究方向。

綜上所述，自發性糖尿病大鼠的抑郁癥行為與大鼠海馬組織中鈣網織蛋白前體、原肌球蛋白1、細胞分裂素活化蛋白激酶1、活化分裂素蛋白激酶1 表達水平下降相關。