CEACAM-1在結直腸癌中的表達及與腫瘤血管生成、轉移的相關性研究

夏龍飛 劉玉君 張軍民 韓俊毅

[摘要] 目的 探討癌胚抗原相關細胞黏附分子1（CEACAM-1）在結直腸癌中的表達及與腫瘤血管生成、轉移之間關系，探討其作為結直腸癌的診斷、治療及預后評價監測指標的可行性。 方法 收集2016年1月～2017年1月舟山市婦幼保健院普外科手術切除的50例結直腸癌組織和50例正常結直腸組織，用免疫組化法檢測CEACAM-1和血管內皮生長因子（VEGF）的表達情況，同時觀察微血管密度值（MVD），分析三者與腫瘤臨床病理特征之間的關系及三者之間的相關性。 結果 CEACAM-1和VEGF在結直腸癌組織中陽性表達明顯高于正常組織中的表達，差異有高度統計學意義（P = 0.000）;結直腸癌組織中MVD值明顯高于正常組織，差異有高度統計學意義（P = 0.000）;結直腸癌組織中CEACAM-1、VEGF的表達和MVD值均與結直腸腫瘤分化程度、漿膜浸潤、TNM分期、脈管浸潤、淋巴結轉移及肝轉移相關（P < 0.05）;結直腸癌組織中CEACAM-1和VEGF陽性表達組中MVD值顯著高于陰性組（P < 0.01）;CEACAM-1與VEGF在結直腸癌組織中的表達呈正相關性（r = 0.483，P < 0.001）。 結論 CEACAM-1高表達能誘導腫瘤微血管的生成，與結直腸癌的浸潤及血行轉移關系密切，CEACAM-1可作為結直腸癌早期診斷、預后監測的潛在分子生物學指標。

[關鍵詞] 結直腸癌;癌胚抗原相關細胞黏附分子-1;血管內皮生長因子;微血管密度;相關性

[中圖分類號] R735.37;R735.35? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（b）-0094-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of CEACAM-1 and the correlation with the tumor angiogenesis and metastasis， and explore feasibility as a monitoring indicator for the diagnosis， treatment and prognosis in evaluating colorectal carcinoma. Methods Fifty specimens of colorectal adenomacarcinoma tissues and 50 specimens of normal colorectal tissues from January 2016 to January 2017 in the Department of General Surgery， Maternal and Child Health Hospital of Zhoushan City were collected. The expression of CEACAM-1， VEGF was detected by immunohistochemistry method， and the value of micro-vascular density （MVD） was observed. The correlation between clinicopathologic features of tumors and expression of CEACAM-1， VEGF and MVD value， as well as the correlation among the three indices was analyzed. Results The positive expression of CEACAM-1 and VEGF in colorectal carcinoma tissues were significantly higher than those in normal tissues， and the differences were highly significant （P = 0.000）; MVD value in colorectal carcinoma tissues was significantly higher than that of normal tissue， and the difference was highly significant （P = 0.000）; the expression of CEACAM-1， VEGF and MVD value were correlated to degree of colorectal tumor differentiation， tumor serous membrane infiltration， TNM staging， vascular infiltration， lymph node metastasis and liver metastasis （P < 0.05）; MVD value of CEACAM-1 and VEGF positive expression groups was significantly higher than that of the negative group in colorectal carcinoma tissues （P < 0.01）; the expression of CEACAM-1 and VEGF were positively correlated in colorectal carcinoma tissues （r = 0.483， P < 0.001）. Conclusion The high expression of CEACAM-1 can induce the formation of tumor microvasculature， and is closely related to the tumor infiltration and metastasis. CEACAM-1 can be used as a potential molecular biological indicator for early diagnosis and prognosis in monitoring colorectal carcinoma.

[Key words] Colorectal carcinoma; CEACAM-1; VEGF; Microvessel density; Correlation

當前結直腸癌的治療主要以手術為主，而手術的前提則是強調早期發現，因此高特異性的生物學指標對結直腸癌的早期發現、早期診斷、早期治療有極其重要的價值。腫瘤細胞的生長依靠新生血管為其提供新陳代謝的基本物質，腫瘤血管密度越大，血供越豐富，生長就越快，轉移風險也越高[1]。癌胚抗原相關細胞黏附分子-1（cancer embryo antigen-related cell adhesion molecules 1，CEACAM-1）作為癌胚抗原家族重要成員之一，能調控細胞增殖、凋亡和分化，同時介導腫瘤細胞的黏附，還參與了血管淋巴管新生等病理生理過程[2]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在人體的多種惡性腫瘤中呈高表達，它最主要的作用就是誘導基質血管形成，并且與多種因子具有協同作用，除此之外還對血管內皮細胞的增殖有促進作用[3]。CD34在腫瘤血管內皮細胞中呈特異性表達，被廣泛用于標記腫瘤內的微血管密度（microvascular density，MVD）[4]。本實驗就是通過對CEACAM-1、VEGF進行免疫組化分析，記錄MVD值，來探討三者與結直腸癌病理的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

標本取自舟山市婦幼保健院（以下簡稱“我院”）普外科2016年1月～2017年1月原發性結直腸癌手術切除的癌組織50例，正常結直腸組織50例（癌組織取自至癌灶邊緣至少10 cm處）。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入標準

經病理檢查確診，均為原發瘤，且病例資料完整無誤。

1.3 排除標準

進行過術前新輔助放化療;轉移瘤;復發性腫瘤;伴有心腦血管疾病及其他手術禁忌證者。

1.4 儀器與試劑

兔抗人濃縮型CEACAM-1單克隆抗體、鼠抗人單克隆濃縮型VEGF抗體由香港ABCAM公司提供，CD34抗體由美國ABNOVA公司提供。

1.5 免疫組化染色方法

10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，應用蘇木精-伊紅染色，行病理診斷。用80℃烤箱對切片進行烘烤30 min，再用乙醇進行脫水，并使內源性過氧化物酶滅活，應用枸櫞酸緩沖液行高溫高壓水化修復過程;PBS洗3次，加入一抗（1∶100）50 μL，溫度控制于4℃一夜;再用PBS洗3次，加入二抗50 μL。室溫下DAB顯色，PBS洗3次，蘇木精輕度復染，鹽酸乙醇分化后流動清水沖洗10 min，梯度乙醇脫水，松節油透明，樹膠行封片處理，PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察[5]。

1.6 判定標準

CEACAM-1和VEGF陽性主要存在于細胞質中，以棕黃色、褐色顆粒為主，計算陽性細胞百分比評分：0分（<5%）為（-），1～4分（5%～<25%）為（+），5～8分（25%～<50%）為（++），9～12分（≥50%）為（+++），（+）～（+++）均視為陽性[6]。

應用CD34抗體標記腫瘤微血管細胞質，依據Weidner法[7]，于200倍光鏡下取4個熱點區，以孤立的棕黃色內皮細胞作為微血管并計數，取其平均值即為MVD值。

1.7 統計學方法

應用SPSS 19.0統計軟件分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson法進行相關性分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CEACAM-1、VEGF和MVD在結直腸癌、正常結直腸組織中的比較

CEACAM-1和VEGF在結直腸癌組織中的陽性表達明顯高于正常組織中的表達，結直腸癌組織中MVD值明顯高于正常組織，差異均有統計學意義（P = 0.000）。表1。

2.2 病理參數與CEACAM-1、VEGF表達水平及MVD的相關性分析

TNM分期高、漿膜浸潤、伴淋巴結轉移、肝轉移和脈管浸潤的結直腸癌患者CEACAM-1和VEGF的表達均增強，MVD值均增高（P < 0.05），而三者的表達與患者腫瘤大小、分化程度無關（P > 0.05）。見表2。

2.3 CEACAM-1、VEGF在結直腸癌組織中的表達與MVD的相關性分析

結直腸癌中CEACAM-1陽性者MVD值明顯高于CEACAM-1陰性者，結直腸癌中VEGF陽性者MVD值明顯高于VEGF陰性者，差異均有統計學意義（P = 0.000）。相關性分析結果顯示，二者在結直腸組織中的表達呈正相關（P < 0.001）。見表3～4。

3 討論

據報道青年結直腸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者，其5年生存率分別為87.9%、75.4%、51.3%、8.0%，而60歲以上老年患者的5年生存率則分別為91.9%、69.8%、52.8%、6.6%，因此早期診斷是提高結直腸癌療效的關鍵[8-9]。但目前臨床常用的腫瘤標志物如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原（CA）-199等的早期檢測并不令人滿意，因而，尋求一種特異性高、敏感性強的結直腸癌早期診斷方法成為目前結直腸癌防控工作的重點[10]。

CEACAM-1是一種跨膜糖蛋白，屬于癌胚抗原家族及免疫超蛋白家族黏附分子之一，在人體內皮細胞、上皮細胞、淋巴細胞等多種細胞中都有較為廣泛的分布。最初由Ocklind等[11]在研究木瓜蛋白酶質膜的不溶性成分的某些作用和功能時被發現。CEACAM-1基因定位于人類染色體的19q13.2區域，該基因的組成是由9個外顯子按特定序列排列而成，在11種剪切方式下，可以生成11個不同的亞型，根據胞內段的長短可分為CEACAM-1-L和CEACAM-l-S兩個亞組[12]。CEACAM-1-L亞組可以形成特定的反式二聚體，聚集在細胞間，介導細胞間的黏附[13-14]。隨著深入研究發現，CEACAM-1還參與了多種復雜的生物學過程，比如它可以參與調節細胞的增殖、凋亡及分化，并對胰島素代謝、微血管及微淋巴管的新生和免疫調節等生理過程具有重要作用[15]。且多項研究證實CEACAM-1參與了腫瘤發生、發展、浸潤與轉移等一系列生物學過程，其異常表達可能是引起和維持結直腸癌惡性表型的原因之一[16]。此外，研究表明CEACAM-1參與腫瘤微血管的異質性生成過程，因此考慮其是腫瘤新生血管的標志物，可作為腫瘤靶向治療的靶點[17]。

VEGF在人體的多種惡性腫瘤中呈高表達，無論是原發性還是繼發性腫瘤，且VEGF表達水平與腫瘤組織中的MVD呈正相關，因此通過阻礙VEGF的信號傳導可以抑制腫瘤血管的生成，阻斷腫瘤的營養供應渠道，從而延緩甚至阻礙腫瘤的發生和發展[18-19]。

本項研究顯示CEACAM-1和VEGF在結直腸癌組織標本中的表達明顯高于正常結直腸組織標本，說明CEACAM-1和VEGF的高表達可以促進腫瘤的發生和發展，影響腫瘤的大小和浸潤深度，使腫瘤對周圍組織器官的侵襲能力增強，淋巴結轉移更快，除此之外還可以發現二者與腫瘤的TNM分期密切相關，影響腫瘤細胞的分化，對結直腸癌患者的預后產生極為重要的作用。與此同時，CEACAM-1可以直接激活VEGF，從而增加MVD值，對腫瘤內部血管的生成起到促進作用，為腫瘤細胞的生長提供充足的營養，使得腫瘤細胞生長更快、侵襲能力更強。本研究支持CEACAM-1和VEGF促進結直腸腫瘤惡性生物學行為進展的理論，與吳濤等[20]研究基本一致。

總之，CEACAM-1的表達異常不僅直接參與了結直腸癌的發生、發展，還間接激活VEGF，促進腫瘤血管新生，增加MVD值，進而影響腫瘤的淋巴轉移、血行轉移等惡性生物學行為。因此，在提倡精準治療的今天，以CEACAM-1為靶點研究相應的靶向藥物將有望成為治療結直腸癌的重要基因手段。

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（收稿日期：2018-07-22? 本文編輯：金? ?虹）