食品中黃曲霉毒素B₁檢測方法研究

張宏博 靳志敏 高智慧 鄭玉山

摘 要：黃曲霉毒素（AF）是廣泛存在于自然界中的真菌毒素，而在所有的真菌毒素中，AFB1的毒性、致癌性較大，其能阻止蛋白、酶和凝血因子合成，又能抑制葡萄糖、脂肪酸、代謝產物的合成，從而引起免疫抑制、脂肪退化和DNA損傷。AFB1的檢測方法大致分為化學分析法、生物鑒定法、儀器分析法三大類，本文主要對運用較為廣泛的TLC（薄層層析）、HPLC（高效液相色譜）、GICA（膠體金標免疫層析分析法）、ELISA（酶聯免疫法）檢測方法進行論述。

關鍵詞：黃曲霉毒素? 毒性? 致癌性? 檢測方法

1 黃曲霉毒素概況及其發病機理

黃曲霉毒素（AF）主要成分是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）產生的有毒性的次生代謝產物，屬于真菌毒素，廣泛存在于自然界中[1，2]。黃曲霉毒素由大約18種化學結構相似的衍生物組成，包括B和G兩大類，植物性食物中產生B1、B2、G1和G2[3]，而乳或乳制品（包括乳酪、奶粉等）中產生M1、M2。黃曲霉毒素B1在植物性食物衍生組中毒性最強，其慢性毒性甚至可誘發肝癌。

AF需要在機體內代謝活化才能表現出毒性。首先，細胞內的多功能氧化酶將AF催化成環氧化物;然后，環氧化物與大分子反應生成DNA、RNA、蛋白質和類脂的結合物，并表現出兩種毒性——急性毒性和慢性毒性，分別表現為AF與蛋白質（包括酶）、類脂的反應可導致細胞的死亡，與核酸的反應可導致突變。研究表明，在所有真菌毒素中，AFB1的毒性、致癌性最大——能阻止蛋白、酶和凝血因子合成，又能抑制葡萄糖、脂肪酸、代謝產物的合成，從而導致免疫抑制、脂肪退化和DNA損傷[4]。

AFB1在動物體中的急性毒性如表1所示，其毒性因動物年齡、種類、性別而異[5]。一般來說，幼年動物對AFB1的敏感性要大于成年動物，雄性動物的敏感性要大于雌性動物。研究表明，當豬飼料中AFB1的含量達到810ppm時，飼料的轉化率下降，豬的體重也明顯下降，甚至會出現死亡，解剖發現其肝臟出現退行性變化，肝細胞大面積壞死。AF除了會對大鼠引起肝癌外，還會使大鼠患上胃癌、結腸癌和腎臟上皮癌[6]。

人體攝入被AF污染的食物后經消化道吸收，其大部分積累在肝臟，少部分分布在腎臟、血液和肌肉中，在機體內通過羥基化、去甲基化和環氧化等作用形成代謝產物使機體致癌、致突變。研究表明，AF的LD50（半數動物致死量）為0.249mg/kg，毒性比氰化鉀高10倍[7]。AFB1在人體內的危害表現為急性毒性和慢性毒性，急性毒性在人體內會出現肝實質細胞壞死、膽管上皮細胞增生、肝脂肪浸潤及肝出血等[8]，前期癥狀為發燒、嘔吐、黃疸，繼而出現腹水和下肢浮腫，最終可導致死亡。AFB1是一種能導致人體遺傳物質發生變化的致突變化合物，其在人體的代謝產物有致突變作用，包括AFB1-2，3-環氧化物、AFM1和AFP1等，其中AFB1-2，3-環氧化物的第2個碳與DNA的鳥嘌呤酮基結合形成AFB1-DNA加合物，去嘌呤反應通過形成AFB1-N7-鳥嘌呤，使DNA分子產生無嘌呤位置的缺口，從而造成DNA損傷，進而可能導致癌變。致癌性表現為AFB1可引起細胞錯誤地修復DNA，從而導致嚴重的DNA誘變，并進一步抑制DNA和RNA的合成，最終抑制蛋白質的合成及基因變化積累[9，10]。目前，科學家已證實p53基因是癌癥的抑制基因，很多人可能在幼年時就受到AFB1的攻擊，加之人體內特定基因的缺失或變異引起p53基因突變，最終導致機體發生癌變[11]。

由于AFB1具有危害性和廣泛性，人們需要有效的檢測方法測定其在食品中的含量，確保對人和家畜的傷害降到最低。目前檢測AFB1的方法很多，但主要分為三大類：化學分析法、生物鑒定法、儀器分析法[12-14]，其中有4種方法的運用較為廣泛，即TLC（薄層層析）、HPLC（高效液相色譜）、GICA（膠體金標免疫層析分析法）、ELISA（酶聯免疫法）。

2 食品中AFB1的幾種檢測方法

2.1 薄層層析法（TLC）

AF是低分子量極性化合物，它的特點是可以吸收紫外光，利用這一特點衍生了多種測定AF的方法，而薄層層析方法是最早被運用的方法。薄層層析法（TLC）同時具有定性和定量的分析功能，所以被美國官方確定為標準方法，我國也在國家標準中將其確立為仲裁法[15]。TLC的原理是利用AFB1在365nm紫外波長下會發出藍色熒光的特點，再經過固相層分離后，對其熒光的強度進行測定，并且與標準液相比，最終得出結果。這種方法不需要專門的儀器設備，成本低，實驗室大都能完成對AF的測定。但是，最原始的薄層分析由于分辨率不穩定，受周圍因素的影響很大，檢測結果不穩定，差異性較大。同時，該方法的工作量比較復雜，耗費時間較長，且在做定量分析時精確度較低?，F如今，隨著科技的迅速發展，出現了很多固相吸附材料，可以使薄層層析的準確度得到提升，其精確度甚至可以與高效液相色譜相較量。張慧麗等通過用黃曲霉菌株接種18種花生仁，利用半定量薄層層析法和精確定量高效液相色譜法檢測到的AF質量濃度確定花生的抗AF合成的能力，鑒定出2個高抗黃曲霉感染和AF質量濃度低的花生品種[16]。

2.2 高效液相色譜（HPLC）

1986年，AOAC International首次將高效液相色譜法（HPLC）作為檢測乳液中AFM1及AFM2公認的方法[17]，也是國內外研究機構認為檢測AF最權威的一種方法，其具有分析自動化的潛力，且具備靈敏度高、精確度高等優點[18]。但是，HPLC對樣品的純度要求很高，必要時需將原料進行衍生才能使用這種方法。經長期研究實踐，研究人員總結出一些使用該方法的技巧。AF的熒光特性受流動相中的液體影響較大，只能檢測到1～2種AF，有的甚至會發生熒光猝滅現象，所以在測定時要同時運用紫外檢測器和熒光檢測器才能將試樣中的AF檢測完全。此外，國內外學者也對高效液相色譜法測定AF進行了系統的研究。陸勤佳等人基于高效液相色譜熒光法設計并完成了一套由分離系統、恒溫控制系統、熒光檢測器、主控板和人機交互界面組成的AF檢測系統，并且經過測試，表明該AF檢測系統具有良好的穩定性——結構緊湊、檢測速度快且靈敏度高，能用于AF的實際檢測[19]。王勇建立AFB1的柱前衍生-高效液相色譜（HPLC）檢測方法，該方法具有良好的準確性、靈敏性和重復性，可對組織樣品中AFB1殘留量進行快速準確分析，為AFB1在食品中的快速檢測奠定基礎[20]。Beaver R、Klaus R等研究發現，在柱后衍生時向其中加入碘，會增強AFB1的熒光度——是之前的25倍，該方法已經被運用到花生制品AFB1的含量檢測中[21，22];該方法需要使用的儀器非常昂貴，一般在進出口檢測實驗室使用。羅朝權等為建立一種快速檢測動物類藥材污染AFB1（AFB1）和AFG1（AFG1）的液質聯用法，并用于水蛭等6種動物類中藥材污染情況的分析，結果表明，土鱉蟲等動物類藥材受AF污染的情況較為嚴重[23]。

2.3 酶聯免疫法（ELISA）

酶聯免疫法在1971年以后開始被運用到實驗中，成為檢測食品中AFB1最簡單、方便的方法之一。ELISA的原理是利用抗原與抗體之間的高度特異性和酶的高效催化性，抗原或抗體與某種載體結合，在檢測時樣品中的酶標抗原抗體與載體上的抗原或抗體會發生反應，產生抗原抗體的復合物，通過添加酶使產生的物質快速顯現顏色，且AF的含量越高，底物的顏色越淺，從而達到檢測的目的，是一種可以定性定量分析的方法[24，25]。該方法的關鍵點首先是抗原或抗體在檢測的過程中要一直保持活性，并且還可以與載體相結合;其次是酶在檢測的過程中要始終保持活性，即使是與抗原或抗體結合后，仍能發揮出酶的催化作用，但這種酶容易受溫度等多種因素的影響，所以一般將其在低溫下保存。常用的ELISA有直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法、抑制性測定法等[26，27]。胡竹行等研究了酶聯免疫法檢測大曲中AFB1的提取條件，結果表明，在甲醇濃度為55%（v/v）、提取時間為25min、功率為200W時，其提取率明顯高于國家標準[28]。當前，為了更加方便而利用ELISA研發出酶聯免疫法分析試紙盒，并且已經商業化生產，為人們的生活提供便利。酶聯免疫法分析試紙盒沒有改變原理，且檢測的準確性十分可靠，該方法目前被廣泛用于飼料原料中檢測AFB1的含量。李江等用酶聯免疫法對食用油中AFB1的測定結果與液相法比較，符合率高，能夠用于食用油中AFB1的快速、準確檢測[29]。

2.4 膠體金標免疫層析分析法（GICA）

納米金是直徑1～100nm的金微小粒子，是一種帶負電的疏水膠體。膠體金標免疫層析分析法就是利用納米金作為標記底物，所需檢測時間較短，可直接讀取檢測數值，且該方法不需要對試樣進行分離提純處理，也不用對檢測溶劑做處理，操作起來簡便且高效[30]，是目前最簡單、最快速的檢測方法之一。GICA會使試樣中的AF與偶聯膠體金的抗AF抗體相結合，無論是結合的還是非結合的抗體都會沿著膜的移動，通過固定化的真菌毒素組成的檢測線，它將結合游離的抗體，以形成可見的線，以此來表示AF的污染低于試驗的閾值[31]。人們對于納米金的研究已經有很長的時間，并在多個領域得到運用。宋青龍等用膠體金免疫層析技術，結合膠體金定量讀數儀研制出一種檢測方法簡便、快速、穩定性好，樣品檢測結果與高效液相色譜法檢測結果的相對誤差在20%以內，快速定量檢測谷物和飼料中AFB1含量的膠體金快速定量檢測試劑盒[32]。劉曉玥等通過用膠體金免疫層析法和酶聯免疫吸附法對飼料樣品的檢測進行對比，結果表明，膠體金免疫層析試紙條法與酶聯免疫吸附法相符率可達95%以上，說明該方法操作簡單、快速、方便，可以應用于谷物及飼料產品AFB1現場快速檢測[33]。

3 小結

AF是廣泛存在于自然界中的真菌毒素，運用較為廣泛的檢測方法有4種——薄層層析法是最早被運用的方法，該方法同時具有定性和定量的分析功能，但隨著科技的發展迅速，如今出現了很多固相吸附材料，使薄層層析的準確度也隨之上升，其精確度甚至可以與高效液相色譜相較量;高效液相色譜法對樣品的純度要求很高，但具有分析自動化的潛力，以及靈敏度高、精確度高等優點;酶聯免疫法的特點是特異性強、靈敏度高、快速、簡便及無污染;而在熒光素、酶、同位素及乳膠標記技術之后，納米金已經成為的一種新型標記技術[34]。

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