山西老陳醋高產糖化酶霉菌的篩選、鑒定及產酶條件優化

王佳麗，朗繁繁，陳旭峰，王如福，許 女*

（1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西紫林醋業股份有限公司，山西 太原 030400；3.山西農業大學 實驗教學中心，山西 晉中 030801）

山西老陳醋素有“天下第一醋”的盛譽[1]，以其“酸醇厚、味清香、回味綿、質濃稠、色紫檀和久貯不變質”的特色深受廣大消費者喜愛[2]。大曲中因含蛋白酶、糖化酶、纖維素酶等幾十種酶類與霉菌、酵母菌等微生物而素有“曲是醋中骨”之稱，其在山西老陳醋的釀造中起到重要的作用。大曲中的霉菌在生長代謝過程中會產生豐富的酶系，尤其是糖化酶，是食醋釀造過程中的重要糖化劑。除了糖化酶，霉菌也會產生一定的蛋白酶，分解原料中的蛋白質生成各種氨基酸和多肽，此類物質的含量是成品食醋質量優劣的一個標準[3]。纖維素酶則可使食醋釀造原料中的纖維素轉化為可發酵性的糖，從而增加了原料中可利用的碳源，還可以破壞原料中的細胞壁結構促進淀粉的溶出，這有利于糖化酶更好地進行糖化[4]。

近年來，一些學者對大曲及釀造中的優良霉菌進行了一些篩選、鑒定、產酶條件優化及糖化酶基因等研究工作。張琳等[5]用Martin培養基對大曲中的霉菌進行分離，分別以透明圈和酶活大小進行初篩和復篩獲得高產糖化酶菌株，其中菌株M6糖化酶活力最高，酶活可達3912.08 U/mL。劉茗銘等[6]從曲中篩選高產糖化酶菌株，通過單因素試驗和正交試驗，確定固態發酵產酶最佳條件為：糠殼添加量4%、接種量1.25%、初始pH值為5.5、料水比5∶3（g∶mL），在30℃條件下培養72 h，其糖化酶活性高達1 791.3 U/g。唐國敏等[7]報道，經多次誘變獲得的黑曲霉T21，其糖化酶基因編碼區序列與BOEL E等[8]報道的黑曲霉糖化酶基因編碼區序列一致，黑曲霉突變菌株T21中穩定態糖化酶信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）含量非常高，這可能是菌株T21糖化酶高產的重要原因之一。

本研究主要從山西老陳醋大曲中分離篩選高產糖化酶的菌株，對其產蛋白酶和纖維素酶的能力進行分析，并對其糖化酶基因進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增、序列比對和氨基酸序列預測，初步探討菌株高產酶活的基因機制，為其進一步基因工程育種研究奠定基礎；在此基礎上還對產酶搖瓶發酵培養基和發酵條件進行了優化，為山西老陳醋釀造專用酶制劑的開發進行研究基礎積累。高產糖化酶霉菌的篩選、鑒定及產酶條件優化為定向選育、定向調控提供理論依據，對山西老陳醋釀造專用酶制劑的開發及山西老陳醋的提質增效具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 霉菌菌株

75株霉菌：分離自山西老陳醋大曲，保存于山西農業大學食品學院生物工程實驗室。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：天津市天力化學試劑有限公司；Maker D、mix：上海生工生物工程股份有限公司；PCR引物：北京六合華大基因科技有限公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基[6]、產糖化酶篩選培養基[5]、麩皮培養基[9]。

液體發酵產酶基礎培養基：麩皮3%，（NH4）2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4 0.03%，CaCl20.03%，pH 5.5。1×105Pa滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

UV-9100紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；Eppendorf離心機：艾本德（中國）有限公司；T100 PCR儀、Universial HoodⅡ型凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；ZQPL-200立式全溫振蕩培養箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；DHP-500電熱恒溫培養箱：北京市光明醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 高產糖化酶霉菌的篩選

將75株霉菌菌株分別接種到產糖化酶篩選培養基上，于30℃靜置培養48 h，向產糖化酶篩選培養基的培養皿中加入4 mL盧戈氏碘液進行染色，分別測量透明圈的大??；用生理鹽水沖洗PDA培養基上的霉菌孢子，制備孢子濃度為106個/mL的孢子懸液，將各霉菌孢子懸液均按2%（V/V）接種量接種于麩皮培養基中，30℃發酵3 d，取樣，采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[10]測定糖化酶的活力。糖化酶酶活定義：1 g酶粉于40℃、pH 4.6條件下，每小時水解可溶性淀粉產生1 mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（U/g）。

1.3.2 高產糖化酶霉菌的篩選

將篩選出的產糖化酶較高的霉菌菌株按照1.3.1方法制備樣品，分別采用福林比色法[10]、DNS比色法[11]測定蛋白酶、纖維素酶的活力。

蛋白酶的酶活定義：1 g固體酶粉在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5）條件下，每分鐘水解酪素產生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位（U/g）。

纖維素酶的酶活定義：1g固體酶粉在40℃和pH值4.2條件下，每分鐘水解纖維素生成1μg的量為一個酶活單位（U/g）。

1.3.3 高產糖化酶霉菌的鑒定

對篩選出的高產糖化酶霉菌菌株進行觀察并記錄菌落的顏色及形態[12]，以及在顯微鏡下觀察菌絲體特征及孢子形態，對菌株進行菌種的初步鑒定[13]。

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法[14]提取基因組。并以此為模板進行PCR擴增。PCR反應體系和條件見參考文獻[15]，PCR反應以ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）為ITS基因序列的上下游引物，用以對ITS序列進行擴增鑒定菌株。擴增產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，測序結果與美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）數據庫中序列進行比對。

1.3.4 高產糖化酶霉菌的糖化酶基因擴增

以1.3.3中所提基因組為模板，按上述方法進行PCR擴增及比對，以P3（5'-CAATGTCGTTCCGAT-3'）和P4（5'-GTCCAGAAGGACTGC-3'）為糖化酶基因序列的上下游引物，用以對糖化酶基因進行擴增。采用NCBI、DNAstar等數據庫和軟件，分析糖化酶基因的同源性，推導蛋白的氨基酸序列，并對編碼蛋白的分子質量、等電點等性質進行預測。

1.3.5 高產糖化酶霉菌的搖瓶培養

按1.3.1方法將調整好孢子懸液濃度的霉菌分別按6%接種量接種于裝液量為100 mL/250 mL液體發酵產酶基礎培養基中，30℃、150 r/min發酵6 d。將產酶發酵液于4℃、4000r/min的條件下離心20min，取上清液，測定糖化酶活力。

1.3.6 產酶發酵培養基及發酵條件的優化

（1）產酶發酵培養基的優化

在液體發酵基礎培養基的基礎上，分別改變其中的碳氮源濃度及起始pH值，考查碳源添加量（麩皮1%、2%、3%、4%、5%）、氮源添加量（硫酸銨0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）和起始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）對發酵液中的糖化酶活力的影響。通過單因素試驗，選取每個因素中最優的3個水平，采用L9（33）正交試驗設計研究碳源濃度、氮源濃度、起始pH值3個因素對菌株產酶的影響。

（2）產酶發酵條件的優化

采用優化后的培養基，分別改變其中的裝液量、接種量及轉速，考查裝液量（50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL）、接種量（4%、6%、8%、10%）和轉速（125 r/min、145 r/min、165 r/min、185 r/min）對發酵液中的糖化酶活力影響。通過單因素試驗，選取每個因素中最優的3個水平，采用L9（33）正交試驗設計研究裝液量、接種量及轉速3個因素對菌株產酶的影響。

2 結果與分析

2.1 高產糖化酶霉菌的篩選及鑒定

糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶，是一種可將淀粉、糊精、糖原水解為葡萄糖，且有助于酵母分解葡萄糖生成乙醇的酶制劑。在大曲研究中，由于關系到淀粉的利用，糖化酶活是關注大曲質量的一項重要指標[16]。

將分離出的75株霉菌分別接種到產糖化酶篩選培養基上，觀察其透明圈的大小。同時將各霉菌制成孢子懸液，分別接種于麩皮培養基中，經過發酵產酶培養后，菌株的糖化酶活力如表1所示。由表1可知，所測霉菌的酶活力差別較大，糖化酶活力最高的霉菌為菌株186，酶活可達4279.11U/g，其次菌株183-2、624-3、2230、896-2、93為糖化酶活力較高的菌株，糖化酶分別為3 963.79 U/g、3 555.73 U/g、3 277.50 U/g、3 027.10 U/g、2 275.89 U/g。

表1 霉菌菌株糖化酶活力測定結果Table 1 Determination results of saccharifying enzyme activity of mold strains

大曲中除了糖化酶，其中的蛋白酶和纖維素酶對于食醋釀造也起到重要的作用，酸性蛋白酶可溶解發酵原料顆粒，促進糖化發酵，降解底物可提供微生物增殖所需的營養小肽、氨基酸等，降解的氨基酸可促進氨基酸的代謝，改善風味成分，提高乙醇濃度[17]；纖維素酶可降解原料中的纖維素，促進淀粉和蛋白的降解，提高發酵率[18]。因此，在篩選高產糖化酶菌株的同時考慮蛋白酶和纖維素酶顯得尤為重要。

將上述篩選的產糖化酶最高的6株霉菌進行蛋白酶和纖維素酶活力的測定，酶活力測定結果如表2所示。由表2可知，菌株186的三種酶活均較高，其蛋白酶和纖維素酶活力分別可達到368.80 U/g和4 476.60 U/g，除了菌株896-2的蛋白酶活力（377.09 U/g）略高于菌株186，其余菌株的蛋白酶活力顯著低于菌株186（P＜0.05），而菌株896-2的纖維素酶（2 806.34 U/g）卻顯著低于菌株186（P＜0.05），因此，菌株186不僅高產糖化酶，且高產蛋白酶和纖維素酶，是高產3種酶的優良菌株。

表2 霉菌菌株糖化酶、蛋白酶及纖維素酶酶活力測定結果Table 2 Determination results of saccharifying enzyme,protease and cellulase activity of mold strains

經篩選后得到高產酶的菌株186，對其進行形態觀察，結果見圖1。由圖1可知，菌株186在PDA培養基上生長的相對較快，但生長蔓延較為局限。生長初期菌絲為白色，后逐漸變為鮮黃色直至變為厚絨狀的駝色，較干燥，菌落外有同心的白色圓圈，菌落背面為淡黃褐色。在PDA液態培養基中振蕩培養時，培養1 d后形成白色菌絲體小球，于顯微鏡下觀察菌絲體，可觀察到菌絲分枝繁茂且具有橫隔，菌絲無色透明。顯微鏡下觀察孢子，可觀察到分生孢子梗無色，頂部形成球形的孢子囊，孢子囊上對生小梗，上長有的分生孢子呈球形、褐色輪廓。

圖1 菌株186的菌落形態、菌絲體形態、孢子囊及孢子梗形態Fig.1 Colonial morphology,mycelial morphology,sporangia and sporophore morphology of strain 186

提取菌株186基因組并對ITS序列進行PCR擴增，測序序列與NCBI數據庫中序列進行比對，下載相近菌株的基因序列，構建系統進化樹，其ITS序列系統進化樹見圖2。由圖2可知，菌株186在系統進化樹上與黑曲霉（Aspergillus niger）同屬于一個分支，與黑曲霉Aspergillus nigerstrain B4/1/VF（登錄號KX901281.1）等的相似度極高，可達100%，結合形態觀察，由此推斷，菌186屬于黑曲霉（Aspergillus niger）。

圖2 菌株186 ITS序列系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain 186 based on ITS sequences

本試驗篩選出的黑曲霉186糖化酶活力顯著高于王旭亮等[19]從不同大曲中分離的黑曲霉在大麥豌豆純種曲培養基中于25℃條件下培養7d的糖化酶活力（495.10～708.5U/g）（P＜0.05）；蛋白酶活則與黃永光[20]從白酒釀造過程中分離的黑曲霉lsq21菌株在麩曲培養基中的蛋白酶活力（373.49 U/g）相近；黑曲霉186纖維素酶活力明顯高于李蘭曉[21]研究的黑曲霉的纖維素酶活力（759.9±51.7）U/g。綜合分析，黑曲霉186在產酶方面表現優良。

2.2 高產糖化酶霉菌的糖化酶基因序列分析

將黑曲霉186的糖化酶基因進行PCR擴增，其糖化酶基因PCR擴增產物電泳檢測結果如圖3所示，其擴增條帶單一，亮度較高。將產物測序所得序列申請登錄號，為MK641588，該基因的DNA序列開放閱讀框長度為1449bp，該基因鳥嘌吟（Guanine）+胞嘧啶（Cytosime）含量為57.76%，NCBI搜索比對后發現，該基因與黑曲霉TCCC41661糖化酶基因（登錄號：KM488271.1）序列同源性達到100%。用DNAstar軟件推導氨基酸序列，詳細序列見圖4。由圖4可知，該基因編碼的酶蛋白由482個氨基酸組成。軟件預測出該酶的分子質量約為51.75 kDa，等電點為3.99。

圖3 黑曲霉186糖化酶基因PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification product of saccharifying enzyme gene ofAspergillus niger186

圖4 黑曲霉186糖化酶基因推導出的氨基酸序列Fig.4 Amino acids sequences derived from saccharifying enzyme gene ofAspergillus niger186

2.3 高產糖化酶霉菌的產酶條件優化

2.3.1 產糖化酶發酵培養基的優化

碳源、氮源添加量及起始pH值對糖化酶活力的影響結果見圖5。由圖5可知，隨著碳源中麩皮含量、氮源中硫酸銨含量以及初始pH值的增加，發酵液中糖化酶活力均呈現先上升后下降的趨勢，在碳源中麩皮含量為4%、氮源中硫酸銨含量為1.0%和起始pH值為7.0時，菌株186的糖化酶活力最高。

圖5 培養基及發酵條件對黑曲霉186糖化酶活力的影響Fig.5 Effect of medium and fermentation conditions on the saccharifying enzyme activity ofAspergillus niger186

通過單因素試驗，選取每個因素中最優的3個水平，即碳源濃度（麩皮含量分別為3%、4%、5%）、氮源濃度（硫酸銨含量分別為0.5%、1.0%、1.5%）和起始pH值（6.0、7.0、8.0），采用L9（33）正交試驗研究碳源濃度、氮源濃度、起始pH值3個因素對菌株產酶的影響，正交試驗結果見表3。由表3可知，產糖化酶的最優培養基條件組合為A2B1C2，即麩皮4%，硫酸銨0.5%，初始pH值為7.0。在此優化培養基條件下，糖化酶活力為898.45 U/mL。

表3 培養基優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for medium optimization

續表

2.3.2 產糖化酶發酵條件的優化

裝液量、接種量及轉速對發酵液中的糖化酶活力影響結果見圖5。由圖5可知，隨著裝液量、接種量及轉速的增加，發酵液中糖化酶活力均呈現先上升后下降的趨勢，在裝液量為100 mL/250 mL、轉速為145 r/min、接種量為6%的條件下，菌株186的糖化酶活力最高。

通過單因素試驗，選取每個因素中最優的3個水平，即裝液量（75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL）、轉速（125 r/min、145 r/min、165 r/min）和接種量（4%、6%、8%），采用L9（33）正交試驗研究裝液量、接種量及轉速3個因素對菌株產酶的影響，正交試驗結果見表4。由表4可知，最佳發酵條件組合為A2B2C3，即裝液量100 mL/250 mL，轉速145 r/min，接種量8%。在此最佳發酵條件下，糖化酶活力為890.56 U/mL。

表4 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

采用上述優化的發酵培養基及工藝，于30℃搖床培養7 d后黑曲霉186的糖化酶活力可達892.98 U/mL，是優化前的1.77倍。

3 結論

本研究以分離自山西老陳醋大曲中的霉菌為研究對象，篩選出1株高產糖化酶的菌株，并且測定結果顯示，其產蛋白酶和纖維素酶的能力也較強，為一株集多種酶活于一身的高產優良菌株，對其糖化酶基因進行PCR擴增、序列比對，該糖化酶基因組DNA序列編碼區長1 449 bp，與黑曲霉TCCC41661糖化酶基因（登錄號：KM488271.1）編碼區序列一致，共編碼482個氨基酸，預測出該酶的分子質量約為51.75 kDa，等電點為3.99。通過單因素試驗和正交試驗，優化液態培養基及發酵條件，得出最優的培養基及發酵條件為：麩皮4%，硫酸銨0.5%，初始pH值為7.0，接種量8%，裝液量100 mL/250 mL，轉速145 r/min，在此優化條件下培養7 d后，黑曲霉186糖化酶活力可達892.98 U/mL，是優化前的1.77倍。