響應面法優化高壓脈沖電場輔助酶解河蚌肉工藝

王靜雅 楊琦 安蘇蘇 張仕勝 周亞軍

摘 要：為研究河蚌肉酶解制備復合調味料工藝，采用高壓脈沖電場輔助酶解，提高氨基態氮得率。以水解度為檢測指標，通過單因素試驗研究復合酶種類、溫度、反應時間、pH值、酶類配比、酶添加量、液料比、脈沖數和電場強度對水解度的影響;在單因素試驗基礎上，采用響應曲面法優化高壓脈沖電場輔助酶解河蚌肉工藝。結果表明：酶解河蚌肉的最佳條件為木瓜蛋白酶、風味蛋白酶質量比1.71∶1、酶添加量1.6%、溫度50 ℃、反應時間4.5 h、pH值6.74、電場強度18.85 kV/cm、液料比50（V/m）、脈沖數8，最終水解度為42.75%，水解度較對照組（36.23%）提高18.0%。

關鍵詞：河蚌肉;酶解;高壓脈沖電場;響應面優化

中圖分類號：TS254.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）02-0025-07

Abstract： High-voltage pulsed electric field-assisted enzymatic hydrolysis was applied to the preparation of composite seasoning from freshwater mussel meat for improve yield of amino nitrogen. The effects of enzyme types and combinations， temperature， reaction time， pH value， enzyme dosage， solid-to-liquid ratio， pulse number and electric field intensity on the degree of hydrolysis were investigated by one-factor-at-a-time method. Subsequently， the selected variables were optimized by response surface methodology. Results showed that the optimum conditions were as follows： papain/flavourzyme ratio 1.71：1， enzyme dosage 1.6%， temperature 50 ℃， reaction time 4.5 h， pH 6.74， electric field strength 18.85 kV/cm， solid-to-liquid ratio 50 （V/m）， and pulse number 8. Under these conditions， the degree of hydrolysis was 42.75%， which was increased by 18.0% compared with 36.23% for the control group.

河蚌是一種貝殼類水生動物，可產珍珠，是中國特有資源[1]，來源廣泛，價格低廉，營養價值高。河蚌肉含有豐富的蛋白質、糖類、維生素和礦物質（銅、鋅），具有高蛋白質、低脂肪的特點[2]，營養價值和藥用價值豐富[3]，且蚌肉的營養成分易溶于汁液，易于被人體消化吸收[4]。王素雅等[5]測定河蚌的基本營養成分，利用酶法制備河蚌功能性產品;郭福軍等[6]研究河蚌酶解液美拉德反應前后風味成分的變化;史萬忠等[7]研究河蚌多糖粗提物的分級醇沉及其活性;Almonacid等[8]對商業消毒蚌肉的工藝收率進行研究;Silva等[9]研究蚌肉酶解的優化條件。

本研究主要探究酶解河蚌肉制備調味料工藝，采用高壓脈沖電場（pulsed electric field，PEF）輔助酶解，提高氨基態氮得率，從而制備營養、風味俱全的復合調味料。PEF輔助酶解的主要原理為：物料細胞膜在電場作用下被擊穿，促使細胞內容物滲出，提高酶與底物的接觸機會[10];適宜的電場強度能改變酶的結構，從而使其活性中心暴露出來，酶活性升高[11];河蚌蛋白在適宜的電場強度下變得松弛，增加與酶的接觸機會，加速酶解[12]。近幾年來，針對PEF的研究主要涉及高壓脈沖的殺菌作用、對微生物、酶的影響和功能物質的提取等方面[13-14]。不少學者研究了PEF技術對于食品新鮮度的保持及對營養成分的影響效果，近年來有望實現工業化應

用[15]。Rahbari等[16]研究高壓電場解凍對雞胸肉蛋白特性的影響;Ding Changjiang等[17]研究高壓電場輔助冷凍豆腐解凍;Delsart等[18]研究脈沖電場和高壓放電對紅酒微生物穩定性和品質特性的影響;周亞軍等[19-20]利用PEF提取河蚌中的多糖及魚骨中的鈣;張鳴鏑等[21]采用PEF破壁法提高了紅松籽的抗氧化肽活性;劉錚等[22]采用PEF破壁法提取廢啤酒酵母中的蛋白質與核酸。PEF技術在制備氨基態氮方面應用較少，本研究將PEF技術應用于河蚌肉酶解中，得到氨基態氮得率高的酶解液，制備營養、風味俱佳的復合調味料，為河蚌肉的加工與調味料制備提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松花江野生河蚌，購于長春市扶余市長春嶺鎮。

甲醛、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 北京化工廠;風味蛋白酶、木瓜蛋白酶（均為食品級） 廣西南寧龐博生物工程有限公司;中性蛋白酶、獼猴桃蛋白酶、無花果蛋白酶（均為食品級） 南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PEF系統（頻率10～5 000 Hz，處理室體積0.75 mm3） 自制;JJ200電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;THZ-98C恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;TGL-16gR飛鴿牌系列離心機 上海安亭科學儀器廠;SHJ-4B恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州高德儀器制造有限公司;PHSJ-4A實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌器（規格DN-300） 浙江新豐醫療器械有限公司;ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;HHS-8S電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海宜昌儀器沙篩廠。

1.3 方法

1.3.1 酶解液制備工藝流程

河蚌→清洗勻漿→加酶水解（PEF輔助）→滅酶→離心→酶解液操作要點：1）原料預處理：清洗河蚌肉，去除蚌肉中的沙子和污物，將蚌肉倒入膠體磨中，加入少量水，制成勻漿，將河蚌肉分裝入袋，放入冰箱備用;2）PEF處理：將上述混合漿液以10 mL/min流速經蠕動泵送至PEF處理室，在一定電場強度、液料比和脈沖數（個）的條件下進行PEF處理;3）制備酶解液：取40 g河蚌肉，按照4∶1的液料比（V/m）加水溶解，放入錐形瓶中，加入不同種類、一定比例的蛋白酶，調至一定溫度和pH值，放入恒溫磁力攪拌水浴鍋中水浴一段時間;4）離心：反應完成后，放置于室溫下冷卻，再放入離心機中離心（4 500 r/min、15 min）后取出上層清液，并記錄上清液質量;5）分析檢測：取20 g上清液至100 mL容量瓶中定容，分別取20 mL定容后的溶液放入3 個錐形瓶中，各加入60 mL蒸餾水，空白實驗取80 mL蒸餾水于錐形瓶中，用甲醛進行滴定，滴定方法參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》。取滴定結果平均值計算水解度，并作柱狀圖或折線圖，對結果進行分析。

1.3.2 指標檢測

實驗以水解度為反應指標，采用甲醛電位滴定法測定離心液中氨基態氮的含量，計算酶解所得蛋白質的質量。水解度按照下式計算。

式中：β為水解度/%;n為甲醛電位滴定法測得氨基態氮物質的量/mol;M為氮元素的摩爾質量（14 g/mol）;K為河蚌肉換算系數，根據GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》，河蚌肉換算系數為6.25;m為河蚌肉質量/g;α為河蚌肉中蛋白質含量（7%），測定方法參照GB 5009.5—2016。

1.3.3 單因素試驗設計

取4 g河蚌肉，按照表1的數據，加水溶解，放入錐形瓶中，調節pH值，加入相應的酶，放入恒溫磁力攪拌水浴鍋中水浴，控制溫度;反應完成后，放置于室溫條件下冷卻，再放入離心機中離心（4 500 r/min、15 min）后取出上層清液，并記錄上清液質量;取20 g上清液至100 mL容量瓶中定容，分別取20 mL定容后的溶液放入3 個錐形瓶中，各加入60 mL蒸餾水，另取80 mL蒸餾水于錐形瓶中作為對照組，用甲醛進行滴定，計算水解度，并作柱狀圖或折線圖，對結果進行分析。

1.3.4 響應面優化試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇溫度、pH值和電場強度3 個影響顯著的因素作為響應變量，利用Design-Expert 8.0.5b軟件，按照Central Composite的中心組合實驗設計原理，以水解度為響應值，通過響應面分析進行酶解條件的優化，得到最優酶解條件。各試驗組的編碼與取值、因子編碼及各變量水平如表2所示。

2 結果與分析

2.1 酶種類對河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、溫度55 ℃、pH值6.5、反應時間4 h、液料比40、脈沖數800、電場強度25 kV/cm的條件下，選用木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、無花果蛋白酶、中性蛋白酶和獼猴桃蛋白酶5 種不同的蛋白酶酶解河蚌肉。

由圖1可知，加入不同種類的酶，河蚌肉的水解度也不一樣。加入木瓜蛋白酶時的水解度最好，其次是風味蛋白酶，無花果蛋白酶、中性蛋白酶和獼猴桃蛋白酶的酶解效果均不理想，與前2 種酶相差較大。根據劉通

訊等[23]對于酶法水解鰱魚蛋白的研究，復合酶的酶解效果優于單一酶。因此，本研究采用木瓜蛋白酶和風味蛋白酶進行復合酶解，這與郭福軍等[6]研究河蚌酶解液美拉德反應前后風味成分的變化實驗所用的酶一致。

2.2 溫度對河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比1∶1、pH值6.5、反應時間4 h、液料比40、脈沖數800、電場強度25 kV/cm的條件下，將溫度分別設定為45、50、55、60、65 ℃酶解河蚌肉。

由圖2可知，隨著溫度的升高，河蚌肉水解度呈先上升后下降的趨勢，在50 ℃時達到最大，50 ℃以后下降趨勢漸漸變緩慢，這是由于溫度低于50 ℃時，酶活性隨溫度升高而增強，而溫度高于50 ℃時，隨著溫度的不斷升高酶活性受到抑制，酶解效果越來越差。這與李梅青等[24]超聲輔助提取明綠豆中的超氧化物歧化酶工藝，譚秀山等[25]研究雞肉蛋白質提取條件的優化結果一致。

2.3 反應時間對河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、pH值6.5、木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、液料比40、脈沖數800、電場強度25 kV/cm的條件下，將反應時間分別設定為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h酶解河蚌肉。

由圖3可知：當反應時間小于4.5 h時，河蚌肉水解度隨著時間的增加而不斷上升;當反應時間大于4.5 h時，河蚌肉水解度隨時間的增加呈現緩慢下降的趨勢。這可能是由于隨著反應時間的不斷增加，反應底物和酶不斷反應，水解度不斷增加;當反應時間大于4.5 h時，酶解效果變化不明顯，可能是由于反應底物和酶完全反應，水解度不再發生明顯變化，而反應時間過長既浪費能源又可能引發不必要的反應。這與黎英等[26]采用超聲波輔助酶法優化提取紅腰豆多糖工藝實驗中的觀點一致。

2.4 pH值對河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、反應時間4.5 h、液料比40、脈沖數800、電場強度25 kV/cm的條件下，將pH值分別設定為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5酶解河蚌肉。

由圖4可知：當pH值小于6.5時，隨著pH值的升高，河蚌肉水解度不斷上升，且上升趨勢不斷加快;當pH值大于6.5時，隨著pH值的升高，河蚌肉水解度不斷降低，這是由于酶需要一個適合的pH值環境，pH值對水解度有很大的影響。這與張輝[27]超聲輔助酶解制備麥麩抗氧化肽工藝研究、王麗等[28]酶法制備白鰱魚蛋白粉研究中的觀點一致。

2.5 木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比對河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、溫度50 ℃、pH值6.5、反應時間4.5 h、液料比40、脈沖數800、電場強度25 kV/cm的條件下，將木瓜蛋白酶與風味蛋白酶的配比分別設為1∶1、1∶2、2∶3、3∶2、2∶1酶解河蚌肉。

由圖5可知：隨著木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比不斷增大，酶解效果先變好后變差，木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比為3∶2時，河蚌肉水解度最高，這是由于木瓜蛋白酶與樣品的結合能力更強，當木瓜蛋白酶占比逐漸增大時，水解度逐漸增高。當水解度增大到一定程度，由于底物有限，因此水解度受到底物濃度限制而不能繼續增大。因此，確定木瓜蛋白酶與風味蛋白酶最佳配比為3∶2。

2.6 酶添加量對河蚌肉水解度的影響

在木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、pH值6.5、反應時間4.5 h、液料比40、脈沖數800、電場強度25 kV/cm的條件下，將酶添加量分別設定為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%酶解河蚌肉。

由圖6可知：隨著酶添加量的增加，河蚌肉水解度不斷上升，且上升趨勢逐漸變緩，在酶添加量為1.6%時，河蚌肉水解度達到最大;酶量繼續增加，水解度沒有太大變化。這可能是由于底物一定時，隨著酶添加量的增加，酶解效果不斷增加，但酶添加量繼續增加時，酶受到底物限制，達到飽和點，并不能與底物繼續結合，因此酶解效果變化不明顯。這與王麗等[28]酶法制備白鰱魚蛋白粉研究中的觀點一致。因此，初步確定酶最佳添加量為1.6%。

2.7 液料比對河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、pH值6.5、反應時間4.5 h、脈沖數8、電場強度25 kV/cm的條件下，將液料比分別設定為20、30、40、50、60酶解河蚌肉。

由圖7可知：當液料比由20逐漸增加時，河蚌肉水解度逐漸增加并趨于穩定;當液料比為50時，河蚌肉水解度最高。這是由于增大溶劑用量時，樣品與溶劑充分接觸，并充分與酶結合;溶劑用量增加至一定程度，樣品與溶劑接觸程度足夠充分，水解度增加不明顯。這與蔣德旗等[29]在響應面優化纖維素酶法提取桂花多糖工藝及其抗氧化活性研究中的觀點一致。

2.8 脈沖數對河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、pH值6.5、反應時間4.5 h、液料比50、電場強度25 kV/cm的條件下，將脈沖數分別設定為6、7、8、9、10酶解河蚌肉。

由圖8可知：當脈沖數為8時，河蚌肉水解度最高;脈沖數從6增加至8時，水解度逐漸增大;脈沖數從8增加到10時，水解度逐漸降低。這是由于增大脈沖數時，細胞破壞程度增加，細胞內容物易于溶出，但脈沖數增加至一定程度會引起分子破壞，使水解度先增加后降低。這與周亞軍等[19]PEF輔助提取河蚌多糖工藝優化研究的結果一致。

2.9 電場強度對河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、pH值6.5、反應時間4.5 h、液料比50、脈沖數8的條件下，將電場強度分別設定為15、20、25、30、35 kV/cm酶解河蚌肉。

由圖9可知：當電場強度為20 kV/cm時，河蚌肉水解度最高;電場強度從15 kV/cm增加至20 kV/cm時，水解度有所增加;電場強度從20 kV/cm增加至35 kV/cm時，水解度逐漸下降。這是由于電場強度增加，細胞孔隙增大，細胞內容物易溶出，易提取細胞內物質，但電場強度增加至某一程度后，介電特性降低，從而水解度降低。這與馬飛宇等[30]對于PEF影響果蔬介電特性實驗與機理分析的觀點一致。

2.10 響應曲面法優化試驗結果

2.10.1 響應面優化方案設計與結果

在試驗結果的基礎上繪制AB、AC、BC的兩因素交互作用響應面3D效果圖。由圖10～12可知，AB、AC、BC的交互作用存在峰值，隨著溫度、pH值、電場強度的不斷增加，河蚌肉水解度呈現先增加后下降的趨勢，pH值對水解度影響較大。溫度與pH值兩因素交互作用的等高線圖為圓形，說明AB交互作用不顯著。溫度與電場強度、pH值與電場強度的交互作用等高線為橢圓，說明AC、BC之間交互作用顯著。

通過單因素試驗找到對河蚌肉水解度影響顯著的因素，并用響應面法分析河蚌肉酶解條件，應用Design-Expert 8.0.5b軟件為各因素取最優值，分別為A=49.86，B=6.74，C=18.58，轉換后得到的最佳提取條件為溫度50 ℃、pH值6.74、電場強度18.58 kV/cm，水解度預測值43.26%。對上述實驗條件進行驗證，得到河蚌肉水解度分別為43.25%、44.14%和43.65%，平均值為42.68%，且重復性較好。

3 結 論

經優化后的河蚌肉酶解條件為酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶與風味蛋白酶配比1.71∶1、溫度50 ℃、pH值6.74、反應時間4.5 h、液料比50、脈沖數8、電場強度18.85 kV/cm。經優化后的酶解條件可使河蚌肉水解度達42.75%，較對照組的36.23%提高18.0%。

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