短期干旱脅迫下棉花氣孔表現及光合特征研究*

王凱麗,高彥釗,李 姍,張夢璐,吳智豪,劉連濤,孫紅春,李存東,張永江

(河北農業大學農學院/河北省作物生長調控重點實驗室 保定 071001)

氣孔是高等植物與外界進行CO2和水汽傳輸的主要通道和調節器官,調節著植物的碳同化和水分散失的平衡關系。Hetherington等[1]指出,氣孔孔隙面積雖只占葉片表面積的5%左右,但從氣孔蒸發的水分高達70%。影響氣孔活動的環境因素包括光照、CO2濃度、空氣濕度以及土壤水分狀況等[2]。在非生物脅迫中,干旱脅迫對植物的危害較大,氣孔調節是植物抵御干旱脅迫和適應環境的機制之一[3]。植物通過控制氣孔的開閉程度和數目調節葉片的蒸騰速率。不同種類植物氣孔在應對不同程度干旱時表現不同。中度土壤干旱條件下,玉米葉片氣孔密度增大,氣孔長度和寬度都變小,且寬度的變幅大于氣孔長度的變幅[4]。燕麥(Avena sativaL.)在輕度干旱下(土壤相對含水量60%)氣孔開啟程度比正常水分條件大,證明燕麥具有典型耐旱作物結構特征[5]。除了引起氣孔形態和運動變化外,干旱會導致氣孔導度下降,進入葉片內部的CO2濃度降低,進而帶來光合速率降低[6-7]。葉綠素熒光參數已被廣泛用于脅迫生理中,但干旱下植物葉片熒光參數的表現不同。干旱降低了棉花葉片PS Ⅱ最大光化學效率(Fv/Fm)、光化學量子效率(φPSⅡ),非光化學猝滅系數(NPQ)升高[8],但也有試驗證明干旱不會降低ETR和φPSⅡ[9-10]。

棉花(Gossypium hirsutumL.)是中國乃至全世界最為重要的經濟作物,其產區多為干旱或半干旱地區,水分供應不足是棉花生產的主要障礙因素之一。關于土壤干旱下棉花光合生理特性的研究已有較多報道[11-12],但關于模擬短期干旱下棉花氣孔形態和運動表現及其光合特征研究并不多見。本研究采用PEG-6000模擬短期干旱,研究不同脅迫天數、干旱程度下棉花葉片氣孔形態和密度、光合參數和葉綠素熒光參數等指標變化,以進一步明確棉花氣孔對干旱的響應特征,了解氣孔調節的真實行為,為提高水分利用效率奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

試驗為室內培養試驗,在河北農業大學西校區農學院智能溫室(保定)內進行。溫室溫光條件為,白天25℃(照光),夜間20℃(不照光)。供試棉花品種為轉基因抗蟲棉‘國欣9號'。種子用75%的酒精消毒滅菌后用蒸餾水浸種,25℃催芽至露白,選取露白一致的種子先種在蛭石中,待棉花幼苗長至2葉一心時(播種后21 d),挑選生長一致健壯的幼苗移至1/4 Hoagland營養液中,3 d更換一次營養液,長至3葉一心(播種后31 d)時使用1/2 Hoagland營養液進行培養,4葉一心時(播種后35 d)使用全Hoagland營養液進行培養,待5葉一心時(播種后51 d)開始模擬干旱脅迫處理。根據預試驗結果,在營養液中加入PEG-6000的濃度分別為：0(對照)、1.5%、3.0%和4.5%。每處理60株。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 葉片水勢測定

采用Model 600型植物壓力室(美國PMS公司),選取倒3葉進行測定,每次重復5株。

1.2.2 氣孔大小和密度

利用BX53數碼顯微攝像系統(日本Olympus公司),待光合參數和熒光參數測定完成后1 h進行。采用指甲油涂抹和透明膠帶相結合的方法,測定葉位為倒4葉。先將指甲油均勻涂抹在葉片背面的取材部位,使其在室溫自然晾干5～10 min(視光照、風等因素確定),將透明塑料膠帶拉開3～4 cm,膠面朝下,粘取指甲油層,用手指抹平膠帶,使膠帶與指甲油層之間充分接觸,沒有氣泡;撕取粘有指甲油層的膠帶,將其粘貼在載玻片上,不另加蓋玻片,每個葉片隨機選取5個視野,在40倍目鏡下觀察測定氣孔密度和氣孔形態特征。1)氣孔長度和寬度(μm)：每個視野隨機選取5個氣孔,測定啞鈴形保衛細胞長度即為氣孔長度,垂直于啞鈴形保衛細胞的最寬值即為氣孔寬度。2)氣孔開度(μm)：每個視野隨機選取5個氣孔,測定氣孔孔徑的寬度用來表示氣孔的開張度。3)氣孔密度：測量出視野面積,計算每幅圖片上的氣孔個數,取平均值,除以圖片面積,得到每個視野的平均氣孔密度(個·μm-2)。

1.2.3 葉片氣體交換參數

采用LI-6400光合儀(美國LI-COR公司),設置內置紅藍光源光強為600 μmol·m-2·s-1,CO2濃度為400 μmol·mol-1,選取倒4葉中部進行測定,獲取凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)。每次測定重復5株。本研究所有測定項目均分別在處理后的1 d、3 d、5 d和7 d進行。

1.2.4 葉綠素熒光動力學參數

采用PAM-2500(德國Walz公司)葉綠素熒光儀,先測定光下葉片實際光化學量子產量 Yield,接著暗適應20 min,獲取最大光化學效率Fv/Fm,計算非光化學淬滅系數 NPQ。測定葉片為光合測定葉,每次重復5株。

1.3 數據處理

數據處理在Microsoft Excel 2010中進行,采用SPSS 20.0 軟件進行差異顯著性統計分析,多重比較采用LSD法,氣孔形態指標和光合參數圖采用Origin Pro 9軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 不同PEG-6000處理對棉花葉片水勢的影響

葉水勢是反映植物體內水分狀況的靈敏的生理指標之一。隨PEG-6000處理濃度的增加,葉水勢顯著下降,說明干旱脅迫越重,葉片水勢越低。如圖1所示,隨PEG-6000處理時間延長,各處理葉片水勢逐漸下降。1.5%濃度在PEG-6000處理后1 d和3 d與對照差異不顯著,5 d差異顯著。3.0%和4.5%濃度在處理后1 d即與對照差異顯著,其中4.5%濃度在處理后1 d、3 d、5 d和7 d分別下降17.65%、21.15%、23.43%和32.45%。表明1.5%處理的第5 d是棉花葉片水勢的臨界條件。干旱導致葉片水勢降低,以便更容易地從溶液中吸收水分。

圖1 不同PEG-6000濃度處理下棉花葉片水勢變化Fig.1 Change of leaf water potential under four PEG-6000 concentrations in cotton

2.2 不同PEG-6000處理對棉花氣孔形態的影響

經不同濃度 PEG-6000處理后,棉花葉片氣孔形態發生明顯變化(圖2)。由圖2可知,隨著處理時間的延長,除對照外,其余 PEG處理的棉花氣孔長度、寬度和開度均呈下降趨勢,氣孔密度呈上升趨勢。處理后1 d,3.0%PEG處理的氣孔長度和寬度與對照差異顯著(P＜0.05)。不同處理間各氣孔指標在處理后3 d開始差別逐漸加大。處理后第7 d,4.5%PEG處理的氣孔長度、寬度和開度比對照分別降低2.61%、4.28%和19.29%,而氣孔密度上升 16.55%(圖3)。表明在干旱初期葉片通過微閉氣孔減少蒸騰,嚴重干旱時氣孔開度的降幅高于氣孔長度和寬度。

圖2 不同PEG-6000濃度處理1 d后棉花葉片氣孔形態變化(A、B、C和D分別對應PEG-6000處理濃度為0、1.5%、3.0%和4.5%)Fig.2 Leaf stomatal morphology of cotton under four PEG-6000 concentrations for 1 day(A：0;B：1.5%;C：3.0%and D：4.5%)

2.3 不同PEG-6000處理對棉花光合參數的影響

隨 PEG-6000處理濃度的增加和處理時間的延長,凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)都呈明顯下降的趨勢(圖4)。與處理后1 d相比,1.5%處理的Pn在第3 d、5 d、7 d分別下降38.37%、47.32%和44.67%,相應地4.5%處理分別下降9.58%、11.02%和31.95%,且與對照之間均差異顯著(圖4A)。Gs也有相似變化趨勢,從第1 d開始加入PEG-6000的各處理與正常處理差異顯著,但自處理后 3 d開始,PEG-6000 1.5%、3.0%和4.5%3個處理間差異不顯著(圖4B)。干旱同樣降低了葉片的蒸騰速率,在每個測定日,加入PEG-6000各處理與正常處理差異均達顯著水平(P＜0.05)。處理后第1 d、3 d、5 d和7 d,4.5%處理相對于正常處理分別下降46.02%、50.49%、63.52%和67.48%(圖4C)。與對照相比,加入PEG-6000處理也不同程度地降低了Ci,處理后各測定日Ci均與對照差異顯著,各干旱處理間的差異小于干旱與對照之間的差異(圖4D)。

圖3 不同PEG-6000濃度處理下棉花氣孔形態指標的變化(A-D分別為氣孔長度、寬度、開度和密度)Fig.3 Leaf stomatal length(A),width(B),aperture(C)and density(D)of cotton under four PEG-6000 concentrations

圖4 不同PEG-6000濃度處理下棉花葉片凈光合速率(Pn,A)、氣孔導度(Gs,B)、蒸騰速率(Tr,C)和胞間CO2濃度(Ci,D)的變化Fig.4 Leaf net photosynthetic rate(Pn,A),stomatal conductance(Gs,B),transpiration rate(Tr,C)and intercellular CO2 concentration(Ci,D)of cotton leaf under four PEG-6000 concentrations

2.4 不同PEG-6000處理對棉花葉片葉綠素熒光動力學參數的影響

隨干旱脅迫程度和處理天數的增加,Fv/Fm整體呈下降趨勢(圖5)。在處理后1 d,各處理間差異不顯著;處理后3 d和5 d,4.5%處理顯著低于對照,而1.5%和3.0%處理與對照差異不顯著;處理后7 d,各處理顯著低于對照,1.5%、3.0%和4.5%處理分別比對照低5.42%、5.55%和9.39%。表明短期輕度干旱脅迫不會對棉花葉片PSⅡ最大光化學效率造成顯著影響,但長期重度干旱脅迫會造成PSⅡ最大光化學效率嚴重下降。

圖5 不同PEG-6000濃度處理下棉花葉片最大光化學效率(Fv/Fm)Fig.5 Leaf maximal photochemical efficiency of PSⅡ in the dark(Fv/Fm)under four PEG-6000 concentrations in cotton

由圖6A可知,經干旱脅迫處理后棉花實際光化學量子產量Yield值總體呈下降趨勢,表明干旱使棉花葉片的光合電子傳遞過程受到了抑制。1.5%處理直到處理后第7 d Yield值才顯著低于對照,3.0%和4.5%處理在處理后第1 d便顯著低于對照,其中4.5%處理在處理后的第1 d、3 d、5 d和7 d分別比正常處理下降20.64%、24.81%、35.07%和19.60%。非光化學淬滅(NPQ)常用來評價植物耗散過剩激發能的能力[13]。由圖6B可以看出,隨著干旱脅迫的加重,NPQ呈上升趨勢。處理后1 d,3個干旱處理的NPQ值均顯著高于對照(P＜0.05);處理后3 d,各干旱處理NPQ值均高于對照,但處理間差異未達顯著水平;處理后5 d和7 d,4.5%處理顯著高于對照,比對照分別提高22.72%和31.82%。表明干旱導致棉花葉片中PSⅡ反應中心耗散過剩光能的能力增強,吸收的光能較多用于熱耗散。

2.5 氣孔形態指標與光合、熒光參數的關系

由表1可見,棉花氣孔長度、寬度和開度之間極顯著正相關(P＜0.01),氣孔寬度和氣孔密度不相關。氣孔長度、寬度和開度與Pn和Yield極顯著正相關(P＜0.01),與NPQ極顯著負相關(P＜0.01),與Gs、Tr和Fv/Fm相關不顯著。

3 討論與結論

氣孔是植物體內水分和CO2與外界環境進行交換的通道,氣孔的大小、多少和調節功能與葉片的光合作用和蒸騰作用等生理過程有密切的聯系[14]。在干旱脅迫下,植物可通過氣孔調節來適應。一般而言,植物葉片氣孔長度、寬度、氣孔開張度會隨著土壤干旱脅迫程度的加重而逐漸降低[7,15-16]。氣孔密度變化因作物種類和脅迫程度不同而異。在輕度至中度脅迫或者脅迫發生的初期,葉片氣孔密度會上升,即適度的干旱可增加葉片氣孔密度[17],而過度干旱或長期干旱則使葉片氣孔密度下降[18]。其原因可能是輕度和中度干旱脅迫使細胞伸長受抑制,導致葉面積減少,即單位面積的氣孔數目增加,氣孔密度上升。嚴重干旱脅迫時,葉片受影響嚴重,抑制了氣孔發生,氣孔數目顯著減少,最終表現為氣孔密度下降[19]。本研究采用PEG滲透脅迫模擬干旱,結果表明隨著脅迫程度的加深,棉花葉片氣孔長度、寬度、開度下降,氣孔密度上升,未發現氣孔密度下降,可能是脅迫程度不夠。此外,有報道稱可通過基因調控降低氣孔密度來提高植物的抗旱性[20]。氣孔關閉的原因受到ABA和/或水力學信號調控[21]。

圖6 不同PEG-6000濃度處理下棉花實際光化學量子產量(Yield,A)和非光化學淬滅(NPQ,B)Fig.6 Photochemical quantum yield(Yield,A)and non-photochemical quenching coefficient(NPQ,B)of cotton under four PEG-6000 concentrations

表1 棉花氣孔形態指標與光合、熒光參數的關系Table 1 Correlation coefficients among leaf stomata morphological parameters,gas exchange and chlorophyll fluorescence parameters under four PEG-6000 concentrations in cotton(n=80)

干旱脅迫對作物光合能力的限制是由氣孔關閉引起還是由碳代謝受損所導致,因植物種類、脅迫程度不同而不同。Ennahli等[22]認為適度水分虧缺下棉花葉片凈光合速率的變化主要是由于葉片氣孔關閉,胞間CO2濃度降低造成的。Ahmed等[23]認為干旱脅迫早期綠豆葉片的Pn迅速下降,但氣孔導度并沒有發生任何變化,隨著干旱脅迫時間的不斷延長氣孔導度才明顯降低,說明干旱脅迫初期非氣孔限制因素是導致Pn降低的主要因素,而后期Pn的降低則主要是由于氣孔關閉導致CO2虧缺造成的。羅宏海等[12]認為花鈴期土壤干旱導致棉花葉片光合速率降低,輕度干旱葉片熒光參數變化不顯著,中度干旱下qP和φPSⅡ顯著下降,NPQ顯著升高。本研究表明,PEG-6000模擬干旱導致棉花葉片氣孔閉合、Ci降低,Pn降低主要受氣孔限制。在應對干旱的響應上,葉綠素熒光參數Fv/Fm在1.5%和3%濃度處理1 d、3 d和5 d均與對照無顯著差異,表明該參數對干旱的敏感性比Yield和NPQ差。這與羅宏海等[12]的結論一致。

本試驗條件下,處理后1 d,各濃度處理的葉片水勢、光合性能明顯下降,說明PEG-6000模擬棉花干旱效果顯著。下一步可以適當降低PEG-6000濃度,或者在處理后數小時內,連續觀測葉片氣孔和光合指標變化,以明確葉片對短時間內干旱脅迫的響應。還可以增加恢復試驗,經脅迫處理一定時間后利用正常營養液繼續培養,研究葉片在干旱解除后的恢復能力。

本研究通過對PEG-6000誘導的棉花葉片氣孔形態、光合和熒光指標分析,發現干旱引起凈光合速率等指標的下降,主要是由氣孔的閉合引起。熒光參數Yield和NPQ比Fv/Fm對干旱反應更敏感。