高產酒精酵母的分離篩選及耐受性的研究

鄭 虹，杜 可，韓艷麗，鄧加聰

（1.福建師范大學福清分校海洋與生化工程學院，福建福清350300；2.現代設施農業福建省高等學校工程研究中心，福建福清350300）

隨著我國經濟的發展，我國對石油的需求日益膨脹，我國已成為第二大能源消耗國。據有關國際能源資料統計和專家預言，全球適合于經濟開采的石油以及天然氣資源只能再開采30～50年，而煤炭也只夠開采300年[1]，因此尋找可再生的替代能源己迫在眉睫。

由于乙醇燃燒只產生水和二氧化碳，對環境不會造成污染，是一種清潔能源，而且生物燃料乙醇作為一種可再生能源[2-4]，具有很大的市場潛力。釀酒酵母是乙醇生產中最常用的發酵菌株，但是乙醇耐受性往往成為限制釀酒酵母乙醇產量的重要因素[5-6]，因此選育耐高溫、耐高糖、耐高濃度乙醇的酵母菌株對于提高乙醇產率具有重要意義[7-11]。彭源德等[12]通過初篩、復篩和紫外誘變，篩選到1株編號為S-132的耐受性優良的酒精酵母，該酵母具有耐40℃高溫和耐16%vol乙醇的能力。

本研究采用自然分離篩選的方法，從分離樣品中獲得耐高溫、耐高糖、耐高濃度乙醇的酵母菌，為酒精生產節能降耗提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

混合菌粉，由龍巖沉缸酒廠提供；蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、瓊脂粉、三苯基四氮唑鹽酸鹽（TTC）等實驗試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

YPD液體培養基（g/L）：蛋白胨20、酵母浸粉10、葡萄糖20，自然pH值。

平板分離培養基：YPD瓊脂培養基。

初篩培養基（g/L）：TTC上層培養基，TTC 0.5，葡萄糖5。

TTC下層培養基：YPD瓊脂培養基。

YFM發酵培養基(g/L)：葡萄糖150，酵母浸粉5，pH值5.0。

斜面保藏培養基：YPD瓊脂。

1.2 主要儀器

SPX-150B-Z型生化培養箱，上海博訊實業有限公司；DHG-90 70A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；THZ-C型臺式恒溫振蕩器，太倉實驗設備廠；W-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；GSP-9050MBE型隔水式恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌粉的富集培養及菌株分離篩選

取1 g混合菌粉，接種于YPD液體培養基，30℃，120 r/min振蕩培養24 h；用無菌蒸餾水將菌液稀釋至 10-7、10-8、10-9，取上述梯度稀釋液0.1 mL涂布于平板分離培養基，30℃倒置培養24 h；將分離得到的具有酵母菌典型菌落的菌株接種于試管斜面，備用。

1.3.2 高產酒精酵母的初篩

將上述挑選到的單菌落，點接于TTC下層平板培養基上，30℃培養24 h，待長出菌落后倒入TTC上層培養基，30℃下放置3 h，挑取顏色變深紅的菌落接種于YPD試管斜面，編號、培養，4℃冰箱保存，備用。

1.3.3 高產酒精酵母的復篩

將初篩得到的菌株接種于YPD試管斜面，30℃活化培養24 h；將活化后的菌株接種于YPD液體培養基，以30℃、150 r/min振蕩培養24 h；將培養后的種子液按5%接種量接種于YFM發酵培養基，30℃靜置發酵72 h，觀察菌株產氣泡的快慢及產量，并測定發酵液中酒精含量。

1.3.4 培養時間對酒精酵母產酒精能力的影響

將復篩得到的菌株，接種于YPD試管斜面，30℃活化培養24 h；挑取1環接種于YPD液體培養基，以30℃、150 r/min振蕩培養24 h；按5%接種量接種于100 mL YFM發酵培養基，30℃下靜置發酵，每隔12 h取樣測定發酵液的酒精度和OD600。

1.3.5 耐受性試驗

（1）耐高溫試驗

將復篩得到的菌株，接種于YPD試管斜面，30℃活化培養24 h；挑取1環接種于YPD液體培養基，以30℃、150 r/min振蕩培養24 h；按5%接種量接種于100 mL YFM發酵培養基，于不同溫度下（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）靜置發酵72 h；測定發酵液的酒精度和OD600。

（2）耐乙醇試驗

將復篩得到的菌株，接種于YPD試管斜面，30℃活化培養24 h；挑取1環接種于YPD液體培養基，以30℃、150 r/min振蕩培養24 h；按5%接種量接種于100 mL YFM發酵培養基，40℃下靜置發酵72 h，測定發酵液的酒精度和OD600。乙醇起始濃度分別為 0、4%vol、8%vol、12%vol、16%vol、20%vol。

（3）耐糖性試驗

將復篩得到的菌株，接種于YPD試管斜面，30℃活化培養24 h；挑取1環接種于YPD液體培養基，以30℃、150 r/min振蕩培養24 h；按5%接種量接種于100 mL YFM發酵培養基，40℃下靜置發酵72 h，測定發酵液的酒精度和OD600。葡萄糖起始濃度為 100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L。

1.3.6 酒精的測定方法

酒精濃度的測定采用酒精比重計法測定[11-12]。

2 結果與討論

2.1 高產酒精酵母菌的分離篩選

從混合菌粉中分離篩選出50株單菌落，經TTC培養基初篩，獲得5株顏色較深的菌株，菌株編號為 S-21、S-31、S-36、S-37、S-40。結果見圖1。

圖1 TTC培養基初篩

將初篩得到的5株酵母菌接種于發酵培養基，進行搖瓶復篩，結果見表1。

表1 不同酵母菌產酒精能力的比較

由表1可見，菌株生物量、產酒精和產氣能力有一定的差異，生物量變化：S-21＞S-36＞S-40＞S-31＞S-37；產酒精能力為：S-21＞S-36＞S-40＞S-37＞S-31；產氣能力為：S-21=S-40＞S-36=S-37＞S-31；其中菌株S-21、S-36、S-40的OD600值和產酒精能力均分別在1.3和8.0%vol以上，而且產氣量也比較多。因此綜合以上實驗結果，選擇菌株S-21、S-36、S-40進行以下實驗。

2.2 培養時間對酒精酵母發酵性能的影響

將菌株S-21、S-36、S-40接種于發酵培養基，每隔一段時間取樣測定發酵液的OD600，探索培養時間對酵母菌發酵及生長性能的影響。結果見圖2。

圖2 培養時間對酵母菌生長及產酒精性能的影響

由圖2可見，菌株S-21、S-36、S-40的生物量和產酒精能力均隨著培養時間的延長呈先升后降的趨勢；當培養時間為72 h時，3株菌株的生物量和酒精度均達到最大值，分別為2.289、2.245、2.393和8.4%vol、9.4%vol、8.9%vol，之后隨著培養時間的延長，菌株的生物量和發酵液中的酒精度減少?？赡芤驗殡S著培養時間的延長，發酵液中營養成分的消耗及廢棄物的積累，不利于菌株的生長；同時隨著培養時間的延長，在培養過程中，發酵液中酒精的揮發，導致越到后面，發酵液中的酒精度反而越低。因此，3株菌株的最適發酵時間均為72 h。

2.3 酒精酵母耐受性的實驗

2.3.1 酒精酵母耐高溫試驗

將活化后的菌株接種于液體發酵培養基，在不同溫度下培養72 h，測定各菌株發酵液的OD600和酒精度，結果見圖3。

圖3 不同培養溫度對酵母菌生長及產酒精性能的影響

由圖3可見，不同菌株的生物量和產酒精能力有一定的差異。菌株S-21、S-36、S-40的生物量和酒精產量均隨著培養溫度的升高呈先升后降的趨勢；在同一溫度下，菌株S-36的生物量和酒精度均高于菌株S-21和S-40；當發酵溫度為40℃時，菌株S-21、S-36、S-40的生物量和酒精產量均達到最高，菌株S-21、S-36、S-40的生物量分別為2.023、2.170、1.833，而酒精產量分別為8.3%vol、9.6%vol、8.5%vol，表明菌株S-21、S-36、S-40均為較好的耐高溫酵母菌株。

2.3.2 酒精酵母乙醇耐受試驗

將活化后的菌株接種于含有不同乙醇濃度的液體發酵培養基，40℃下培養72 h，測定各菌株發酵液的OD600，結果見圖4。

圖4 不同乙醇濃度對酵母菌生長的影響

由圖4可知，隨著發酵培養基中乙醇濃度的增加，菌株S-21、S-36、S-40的生物量均隨著培養基中乙醇濃度的增加逐漸減少，表明高濃度的乙醇會抑制酵母菌的生長發育；當乙醇濃度一致時，菌株S-36的生物量均高于菌株S-21和菌株S-40，說明菌株S-36的生長繁殖情況比其余兩株菌好，對乙醇具有更好的耐受性?？傊?，菌株S-21、S-36、S-40均具有較好的乙醇耐受性。

2.3.3 酒精酵母糖濃度耐受試驗

將活化后的菌株接種于含有不同葡萄糖濃度的液體發酵培養基，40℃下培養72 h，測定各菌株發酵液的OD600和酒精度，結果見表2。

由表2可見，菌株S-21、S-36、S-40的生物量和酒精度均隨著培養液中葡萄糖濃度的增加呈先升后降的趨勢；在同一葡萄糖濃度的發酵液中，菌株生物量和酒精度的大小順序均為S-36＞S-21＞S-40；當培養基中葡萄糖濃度從150 g/L上升到200 g/L時，3株菌的生物量和酒精產量均大幅度上升，當發酵液中葡萄糖初始濃度為200 g/L，3株菌的生物量和酒精度均達到最大值，菌株S-21、S-36、S-40的生物量分別為2.029、2.134、2.016，而酒精產量分別為 8.5%vol、9.7%vol、8.2%vol，當葡萄糖濃度從200 g/L到300 g/L，3株菌的生物量和酒精度變化均不大?？傊?，3株菌均有較好的耐糖性。

表2 初始葡萄糖濃度對酵母菌生長和酒精產量的影響

3 結論

經過酵母菌的分離試驗，初步篩選、復篩，探究培養時間對酵母菌發酵性能的影響以及酵母菌的耐受性等一系列試驗可得出以下結論：

（1）經過酵母菌的富集培養、繼代培養，通過TTC平板顯色實驗，篩選得到5株顯色較深的酵母菌，然后經過產氣和產酒精能力復篩最終得到菌株S-21、S-36、S-40這3株產氣和產酒精能力較強的酵母菌。

（2）對這3株菌的耐受性實驗研究，發現這3株菌可耐40℃高溫，耐200 g/L高糖，耐20%vol高乙醇濃度的能力。