野生與養殖黑斑蛙肌肉營養品質的比較分析

何志剛，伍遠安,2，徐永福,，王冬武,2，陳建國，李金龍

( 1.湖南省水產科學研究所，湖南 長沙 410153； 2.水產高效健康生產湖南省協同創新中心，湖南 常德 415000； 3.南縣豐年生態黑斑青蛙養殖有限公司，湖南 益陽 413200 )

黑斑蛙(Rananigromaculata)是中國分布最廣的兩棲動物之一[1]。黑斑蛙肌肉肉質細嫩，營養豐富，是我國重要經濟兩棲動物之一。長期以來，由于人類的過度捕食、棲息地生境破碎與改變、稻田農藥化肥過度使用及環境污染等影響，野生黑斑蛙種群數量不斷下降[2]。為了滿足市場需求和挽救野生黑斑蛙自然資源，其人工養殖業已開展，湖南省、湖北省依法開放辦理黑斑蛙人工馴養繁殖經營許可證，批準養殖經營[3]。2017年黑斑蛙人工養殖面積約60 hm2，黑斑蛙飼料市場容量達5×104t，但缺乏飼料營養成分基礎研究[4-5]。有關黑斑蛙研究報道主要集中于生理、遺傳、寄生蟲和農藥重金屬毒性等方面[6-10]，對其肌肉營養成分的研究未見報道。諸多研究報道表明，不同養殖模式下水產品的營養品質有一定差異。人工養殖黑斑蛙投喂膨化飼料，生長環境和飼料營養成分變化對其營養價值的影響是決定黑斑蛙保護開發及人工養殖的關鍵。筆者對野生與養殖黑斑蛙肌肉的一般營養成分、氨基酸含量、脂肪酸含量、礦物元素含量進行測定分析，對其肌肉品質進行全面評價比較，旨在為黑斑蛙野生資源保護及開發利用提供基礎資料，并同時為黑斑蛙人工養殖及其配合飼料的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料采集

試驗用野生黑斑蛙成蛙于2017年7月捕獲于湖南省益陽大通湖，共30只，體質量52～101 g，體長8.2～12.8 cm；養殖黑斑蛙(投喂膨化配合飼料)取自南縣豐年生態黑斑青蛙養殖有限公司，共30只，體質量56～113 g，體長8.5～13.2 cm。配合飼料的營養成分組成：水分9.34%、粗蛋白質41.90%、粗脂肪5.78%、粗灰分9.48%。

1.2 樣品處理

野生組與養殖組黑斑蛙各30只，每組設置3個平行。解剖剝取黑斑蛙兩后肢肌肉，用多功能絞肉機絞碎、混勻，-20 ℃條件下保存備用。肌肉樣品分成4份，分別用于測定一般營養成分、氨基酸組成、脂肪酸組成和礦物元素含量。每個指標重復測定3次。

1.3 測定方法

1.3.1 一般營養成分測定

水分含量的測定參照105 ℃恒溫烘干法(GB 5009.3—2016)進行，粗蛋白含量測定參照凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)進行，粗脂肪含量測定參照索氏抽提法(GB 5009.6—2016)進行，灰分含量測定參照馬福爐550 ℃灼燒法(GB 5009.4—2016)進行。

1.3.2 氨基酸和脂肪酸測定

氨基酸采用鹽酸水解法(GB 5009.124—2016)，使用Syknm S7130氨基酸自動分析儀測定。樣品稱取后放入水解管，加入15 mL 6 mol/L的鹽酸，冷凍充入高純氮氣迅速封口置于恒溫干燥箱110 ℃水解22 h，溶液冷卻過濾定容至50 mL容量瓶，吸取1 mL濾液至15 mL試管，用試管濃縮儀減壓干燥揮發鹽酸，加水2 mL溶解后再次蒸干。準確加入2 mL pH 2.2的檸檬酸鈉溶液溶解，過0.22 μm濾膜上機測試。

脂肪酸組成采用氣相色譜/質譜法，使用7890C-5975A氣相色譜—質譜聯用儀測定。采用改進的Folch法萃取總脂[11]，在總脂中加入1 mL 10%濃硫酸—甲醇溶液，60 ℃水浴甲酯化15 min后冷卻。加入正己烷1 mL振蕩，靜置分層后取上清液上氣相色譜—質譜聯用儀分析。氣相色譜條件如下：

色譜柱：HP-88毛細管柱(100 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升溫，初始溫度40 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至220 ℃保持25 min，再以5 ℃/min升至250 ℃；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃，進樣量0.2 μL，分流比50∶1；

質譜條件：離子源為EI，溫度230 ℃，電離能量70 eV；

MS接口溫度280 ℃；美國國家標準技術研究所08標準譜庫檢索；按照出峰先后順序定性，采用面積歸一法計算各主要脂肪酸的相對百分比含量。

1.3.3 礦物元素測定

礦物元素(除鉛元素外)采用微波消解—電感耦合等離子體—質譜法(GB 5009.268—2016)，使用Thermo Fisher Xseries 2電感耦合等離子體質譜儀測定，鉛元素采用石墨爐原子吸收光譜法(GB 5009.12—2010)，使用Thermo Fisher iCE3500原子吸收分光光度計測定。

1.4 氨基酸評價方法

黑斑蛙肌肉氨基酸依據聯合國糧農組織/世界衛生組織建議的氨基酸評分標準模式和中國預防醫學科學院提出的全雞蛋蛋白質化學評分模式，按下式計算氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)和必需氨基酸指數(EAAI)[12-13]：

式中，Aa為試驗樣品氨基酸含量，Ab為聯合國糧農組織/世界衛生組織評分標準模式中同種氨基酸含量，Ac為全雞蛋蛋白質中同種氨基酸含量，A、B、C、…、I為待評價蛋白質的必需氨基酸含量，AE、BE、CE、…、IE為全雞蛋蛋白質的必需氨基酸含量。單位均為mg/g。n為比較必需氨基酸個數。

1.5 脂肪酸評價方法

采用致動脈粥樣硬化指數(IA)和致血栓形成指數(IT)評價黑斑蛙肌肉脂肪酸品質[14]。

式中，Ca為十二烷酸，Cb為十四烷酸，Cc為十六烷酸，m為多不飽和脂肪酸，p為高不飽和脂肪酸，Cd為十八烷酸，pa為n-6高不飽和脂肪酸，pb為n-3高不飽和脂肪酸。

1.6 數據處理

原始數據經Excel 2007整理后，使用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，顯著性水平為0.05，統計數據用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 一般營養成分測定結果

野生黑斑蛙水分含量高于養殖黑斑蛙，粗蛋白、粗脂肪和灰分含量略低于人工養殖黑斑蛙，但差異均不顯著(P>0.05)(表1)。這與Cagiltay等[15]對野生與養殖澤蛙(R.ridibunda)肌肉營養成分研究結果相同。

表1 野生與養殖黑斑蛙肌肉的一般營養成分(濕質量) % >

2.2 氨基酸組成

野生和養殖黑斑蛙肌肉氨基酸組成見表2(色氨酸破壞未測)。由表2可知，黑斑蛙肌肉含有17種常見氨基酸，其中7種必需氨基酸，2種半必需氨基酸、8種非必需氨基酸。野生黑斑蛙肌肉谷氨酸含量顯著高于人工養殖，而酪氨酸及芳香族氨基酸含量顯著低于人工養殖(P<0.05)。除谷氨酸和酪氨酸外，野生與養殖黑斑蛙肌肉其他15種氨基酸含量差異均不顯著(P>0.05)。野生黑斑蛙肌肉的必需氨基酸僅有蘇氨酸，非必需氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和脯氨酸高于養殖黑斑蛙，其他氨基酸含量則略低于養殖黑斑蛙。

表2 野生和養殖黑斑蛙肌肉氨基酸組成(干物質基礎) %

注：*:必需氨基酸; ★:半必需氨基酸; #:鮮味氨基酸;◆:支鏈氨基酸;■:芳香族氨基酸.同行數據肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05).下同.

17種氨基酸在野生與養殖黑斑蛙肌肉中含量高低順序相同，含量最高均為谷氨酸(15.04%，13.95%)，其次是天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸、丙氨酸和精氨酸，含量最低的為胱氨酸(0.21%，0.21%)。

野生黑斑蛙的總氨基酸、非必需氨基酸、鮮味氨基酸總含量高于養殖黑斑蛙，而必需氨基酸、半必需氨基酸、支鏈氨基酸和芳香族氨基酸總含量低于人工養殖。野生黑斑蛙鮮味氨基酸/總氨基酸為32.31%，相比養殖黑斑蛙(30.90%)要高，其他氨基酸比值均低于養殖黑斑蛙。

2.3 氨基酸營養品質評價

將黑斑蛙肌肉必需氨基酸百分含量換算成每克氮中含氨基酸毫克數，與聯合國糧農組織/世界衛生組織制定的蛋白質評價氨基酸標準模式及全雞蛋蛋白質氨基酸模式相比較，計算得出氨基酸評分、化學評分和必需氨基酸指數(表3)。由表3可知，養殖黑斑蛙肌肉必需氨基酸含量為2261.90 mg/g，高于聯合國糧農組織/世界衛生組織模式(2190 mg/g)，低于全雞蛋蛋白質模式(2959 mg/g)。而野生黑斑蛙肌肉中必需氨基酸含量為2180.64 mg/g，均低于兩種氨基酸模式。養殖與野生黑斑蛙肌肉賴氨酸含量(503.75、491.88 mg/g)均高于兩種氨基酸評價模式(340、441 mg/g)。

表3 野生和養殖黑斑蛙肌肉中必需氨基酸與聯合國糧農組織/世界衛生組織模式及雞蛋蛋白標準模式比較 mg/g

野生與養殖黑斑蛙肌肉中除蛋氨酸+胱氨酸外，其他各必需氨基酸的氨基酸評分均大于0.85，化學評分均大于0.65(表4)，而且養殖黑斑蛙肌肉必需氨基酸除蘇氨酸之外，氨基酸評分和化學評分均比野生黑斑蛙要高，說明養殖黑斑蛙肌肉必需氨基酸組成比例相比野生黑斑蛙更接近標準，營養價值更高。

氨基酸評分、化學評分和必需氨基酸指數是比較分析動物肌肉必需氨基酸組成、評價蛋白質營養價值的主要指標。根據氨基酸評分來判斷，野生與養殖黑斑蛙第一限制性氨基酸是蛋氨酸+胱氨酸，第二限制性氨基酸則分別為纈氨酸和蘇氨酸；由化學評分可見，野生與養殖黑斑蛙第一和第二限制性氨基酸分別為蛋氨酸+胱氨酸、纈氨酸。養殖黑斑蛙肌肉必需氨基酸指數為72.42，高于野生黑斑蛙的70.25。

表4 野生和養殖黑斑蛙肌肉的必需氨基酸組成評價

注：a.第一限制性氨基酸；b.第二限制性氨基酸.

2.4 脂肪酸組成與評價

野生和養殖黑斑蛙肌肉脂肪酸組成較為相似，均含有28種脂肪酸，其中包含11種飽和脂肪酸、8種單不飽和脂肪酸和9種多不飽和脂肪酸(表5)。從脂肪酸含量來分析，野生和養殖黑斑蛙均為單不飽和脂肪酸>多不飽和脂肪酸>飽和脂肪酸，其中野生黑斑蛙肌肉中飽和脂肪酸含量顯著高于養殖黑斑蛙(P<0.05)，而兩者間單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量差異不大(P>0.05)。野生與養殖黑斑蛙各脂肪酸中相對含量最高的均為油酸(C18:1n9)(37.48%，35.86%)，其次為亞油酸(C18:2n6)(21.60%，21.74%)，再次為棕櫚酸(C16:0)(12.73%，12.53%)。養殖黑斑蛙二十碳五烯酸(C20:5n3)和二十二碳六烯酸(C22:6n3)的含量分別比野生黑斑蛙高出15.1%和21.2%(P>0.05)，必需脂肪酸和花生四烯酸(C20:4n-6)的含量也分別比野生黑斑蛙高出1.41%和11.1%，但野生和養殖樣本間差異不顯著(P>0.05)。除了二十三碳酸(C23:0)和飽和脂肪酸的含量差異顯著(P<0.05)外，其他脂肪酸含量在野生和養殖黑斑蛙之間差異均不顯著(P>0.05)。

野生和養殖黑斑蛙肌肉n-6與n-3多不飽和脂肪酸含量的比值分別為2.6∶1和2.3∶1。除此之外，野生與養殖黑斑蛙肌肉的致動脈粥樣硬化指數分別為0.21和0.21，致血栓形成指數分別為0.27和0.26。

表5 野生和養殖黑斑蛙肌肉脂肪酸組成 %

注：SFA，飽和脂肪酸；MUFA，單不飽和脂肪酸；PUFA，多不飽和脂肪酸；EFA，必需脂肪酸；IA，致動脈粥樣硬化指數；IT，致血栓形成指數.

2.5 礦物元素含量及營養評價

野生與養殖黑斑蛙肌肉礦物元素含量見表6。常量元素中，野生黑斑蛙鉀和鈉含量比養殖黑斑蛙分別高出3.98%和22.8%，鎂和鈣含量則比養殖黑斑蛙分別低了17.3%和68.4%；微量元素中，野生黑斑蛙鋅和鋁含量分別低于養殖黑斑蛙20.9%和21.7%，差異顯著(P<0.05)，硒含量則顯著高于養殖黑斑蛙(P<0.05)。野生與養殖黑斑蛙重金屬砷含量分別為0.07 mg/kg和0.03 mg/kg，鉛含量分別為0.05 mg/kg和0.04 mg/kg，鎘含量分別為0.001 mg/kg和0.002 mg/kg，汞未檢出，均在GB 2762規定的允許范圍內。

表6 野生和養殖黑斑蛙肌肉礦物質元素含量 mg/kg

3 討 論

3.1 黑斑蛙常規營養成分與其他蛙類的比較

蛋白質是食物諸多營養素中首要的，也是機體結構功能不可或缺的基礎營養素。本試驗研究表明，黑斑蛙粗蛋白含量高于棘胸蛙(R．spinosa)[16]、食用蛙(R．esculenta)[17]、中國林蛙(R．chensinensis)[18]、牛蛙(R．catesbeiana)[19]、棘腹蛙(R.boulengeri)[20]、桑植趾溝蛙(R．sangzhiensis)[21]，略低于中國虎紋蛙(R．tigrina)[22]；黑斑蛙粗脂肪含量低于食用蛙[17]、桑植趾溝蛙[21]、中國虎紋蛙[22]等蛙類，也遠低于常見經濟淡水魚類鯽魚(Carassiusauratus)、草魚(Ctenopharyngodonidella)、烏鱧(Ophiocephalusargus)、鱖魚(Sinipercachuatsi)和鳊魚(Parabramispekinensis)[23]。由此可見，黑斑蛙是一種蛋白質含量較高、脂肪含量較低的經濟蛙類。野生黑斑蛙除水分高于養殖黑斑蛙外，粗蛋白、粗脂肪和灰分含量均低于后者。

3.2 野生和養殖黑斑蛙氨基酸組成分析及營養品質評價

氨基酸特別是必需氨基酸含量的高低與比例，能夠與人體的8種必需氨基酸相吻合，營養價值才高，易被人體吸收利用[24]。由試驗結果可知，野生與養殖黑斑蛙肌肉中總氨基酸含量(分別為80.99%和80.78%)和必需氨基酸含量(39.27%和40.41%)很高，均高于中國林蛙、棘胸蛙、牛蛙、棘腹蛙和中國虎紋蛙。有研究表明，野生水生動物肌肉的總氨基酸和必需氨基酸含量會高于養殖群體，如銀鯧(Pampusargenteus)[25]，即使投喂商品配合飼料，野生草魚肌肉總氨基酸和必需氨基酸含量仍顯著高于人工養殖草魚[26]，分析認為可能是配合飼料品質低于野生群體攝食天然餌料；也有研究指出，養殖1齡的紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[24]肌肉總氨基酸和必需氨基酸含量均顯著高于野生1齡的含量，原因可能是養殖紅鰭東方鲀攝食冰鮮魚，營養成分組成接近天然餌料，餌料數量較野生環境充足，因此營養物質積累相對優于野生群體。本試驗中，野生黑斑蛙肌肉中總氨基酸含量高于養殖黑斑蛙，而必需氨基酸含量則低于養殖群體。動物蛋白質的鮮味在一定程度上取決于鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)的組成和含量[27]，而谷氨酸是一種重要的風味氨基酸，能夠改善肌肉營養組成，具有濃烈鮮味[28]。試驗結果表明，野生黑斑蛙肌肉谷氨酸的含量顯著高于養殖黑斑蛙，鮮味氨基酸總量也高于養殖黑斑蛙，說明野生黑斑蛙肌肉相比養殖黑斑蛙味道更鮮美。

按照聯合國糧農組織/世界衛生組織建議的理想模式，質量較好的蛋白質氨基酸組成中必需氨基酸/總氨基酸比值應約為40%，而必需氨基酸/非必需氨基酸應在60%以上[29]。試驗結果表明，野生和養殖黑斑蛙肌肉氨基酸組成均遠超過上述指標要求，屬于優質食物蛋白源。必需氨基酸指數以全雞蛋蛋白質必需氨基酸作為評價標準，是評價蛋白質營養價值的常用指標之一，指數值越高，說明氨基酸組成越平衡，蛋白質利用率越高[23,25]。野生黑斑蛙必需氨基酸指數為70.25，略低于養殖黑斑蛙的72.42，遠高于虎紋蛙(Hoplobatrachusrugulosa)的43.83[27]，說明黑斑蛙肌肉必需氨基酸組成較為平衡。野生和養殖黑斑蛙肌肉賴氨酸含量很高(分別為7.87%和8.06%)，遠高于虎紋蛙[27]、牛蛙[19]、棘胸蛙[16]。從本試驗可知，野生和養殖黑斑蛙的主要限制性氨基酸為蛋氨酸+半胱氨酸和纈氨酸，因此在飼料配方的調整過程中需要注意這些氨基酸的補充與平衡。

3.3 野生和養殖黑斑蛙脂肪酸組成分析及營養品質評價

野生和養殖黑斑蛙肌肉脂肪組成均為單不飽和脂肪酸>多不飽和脂肪酸>飽和脂肪酸。飽和脂肪酸中以棕櫚酸含量最高，硬脂酸C18:0次之。前者能降低血清膽固醇，有一定保護胰島素功能[30]，后者能夠減少腸道膽固醇吸收從而降低肝臟中膽固醇含量[31]。單不飽和脂肪酸適量攝入對改善高血壓人群效果明顯，能有效降低低密度脂蛋白水平和冠心病發生率[32]。野生黑斑蛙中單不飽和脂肪酸含量最高為油酸，高達37.48%，比養殖黑斑蛙油酸含量要高，這與于久翔等[24]對紅鰭東方鲀報道相同。油酸可降低血液總膽固醇和有害膽固醇，對人體具有重要的營養和保健功能[33]。養殖黑斑蛙n-3脂肪酸含量高于野生黑斑蛙15.15%，這與澤蛙研究報道相類似[15]，可能是由于野生與養殖蛙食物餌料來源組成不同所致。野生與養殖黑斑蛙肌肉二十碳五烯酸+二十二碳六烯酸含量分別為6.57%和7.84%，均高于中國林蛙[18]和澤蛙[15]。

必需脂肪酸是人類身體的重要元素，且自身無法合成，必須從食物中獲取。黑斑蛙肌肉富含人體所必需的3種脂肪酸，如亞油酸、亞麻酸(C18：3)和花生四烯酸。特別是人體不能合成的亞油酸，野生與養殖黑斑蛙含量較高，分別為21.60%和21.74%，遠高于澤蛙(8.4%)[15]、虎紋蛙(12.3%)[27]、中國林蛙(13.4%)[18]和7種淡水經濟魚類[23]。亞油酸能降低血液膽固醇，預防動脈粥樣硬化，減少心腦血管疾病發生。

致動脈粥樣硬化指數和致血栓形成指數用于評價脂肪酸導致心腦血管疾病風險，值越大，危險性越高[14]。野生與養殖黑斑蛙肌肉脂肪致動脈粥樣硬化指數和致血栓形成指數分別為(0.21，0.27)和(0.21，0.26)，顯著低于豬肉(0.60，1.37)、羊肉(1.00，1.58)、牛肉(0.72，1.06)和野生巖原鯉(Procyprisrabaudi)(0.45，0.36)[36]，表明黑斑蛙肌肉脂肪酸誘發冠心病風險極低，具有良好的保健功能。

3.4 野生和養殖黑斑蛙礦物元素組成分析

礦物元素分析結果表明，野生與養殖黑斑蛙肌肉含有豐富的人體必需鉀、鈉、鈣、鎂、鋅、硒等元素。礦物元素含量最高為鉀，分別達到3915.00 mg/kg和3765.33 mg/kg，其次是鈉，含量分別達490.93 mg/kg和399.33 mg/kg，均遠高于食用蛙[17]、中國林蛙[18]、虎紋蛙[27]，與澤蛙[15]含量相近。鉀和鈉參與細胞生理代謝過程，起著調節機體水平衡和維持人體正常滲透壓和血壓的關鍵作用[37]。鎂在野生與養殖黑斑蛙肌肉中的含量僅次于鉀和鈉，作為輔酶因子之一在能量代謝、蛋白合成、RNA和DNA合成，以及維持神經組織和細胞膜生物電位等方面起著重要作用[17]。野生黑斑蛙肌肉鈣含量比養殖黑斑蛙減少68.44%，原因可能是攝食天然餌料鈣元素含量相比配合餌料缺乏，攝食沉積量相應減少。鈣離子除了在骨骼生長發育起重要作用外，還參與多種酶的活化和細胞信號傳導。

野生與養殖黑斑蛙肌肉微量元素排序相同，鐵含量最高，其次是鋅、鋁、硒、銅。野生黑斑蛙肌肉中鋁顯著低于養殖黑斑蛙，這一結果同野生與養殖黑線鱈(Melanogrammusaeglefinus)[38]脊椎鋁含量報道相一致，與黑線鱈肌肉鋁含量相反，可能是因為硅作為應對急性鋁中毒的重要元素，黑線鱈在脊椎中與硅協同作用從而蓄積了更多的鋁。

4 結 論

野生和養殖黑斑蛙肌肉蛋白質含量高，脂肪含量低，氨基酸組成合理，必需氨基酸與總氨基酸及非必需氨基酸的比值高于聯合國糧農組織/世界衛生組織推薦優質蛋白質氨基酸模式；游離氨基酸中鮮味氨基酸含量豐富，占氨基酸總量比例高，賦予肌肉濃郁的鮮美風味。野生和養殖黑斑蛙肌肉含有豐富的不飽和脂肪酸和必需脂肪酸，致動脈粥樣硬化指數和致血栓形成指數較低，對人體膳食脂肪健康與平衡具有重要幫助。此外，黑斑蛙肌肉中含有豐富的鉀、鈉、鎂、鈣、鐵、鋅等礦物元素，參與重要的生理作用。因此，黑斑蛙是平衡膳食營養結構的優質來源，是一種營養價值高、味道鮮美的保健食品，而且養殖黑斑蛙肌肉營養品質接近并且部分指標優于野生黑斑蛙，具有良好的開發利用與人工養殖前景。