老年非酒精性脂肪性肝病痰濕質患者與瘦素受體和脂聯素基因多態性的關聯研究*

王 僑 王睿瑞 李 東 王健英 張 磊 賀 光 季 光,4 劉保成△

1.上海中醫藥大學中醫健康服務協同創新中心 (上海， 201203) 2.上海市浦東新區張江社區衛生服務中心 3.上海交通大學Bio-X研究院 4.上海中醫藥大學附屬龍華醫院脾胃病研究所

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種常見的慢性肝臟疾病，以體內大量脂肪堆積導致肝臟體積增加5%～10%并且無過量飲酒史 (男性≤30 g/d；女性≤20 g/d)的一種病理狀態[1, 2]。NAFLD的疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝癌等[3]。中醫體質學說認為，體質是人體在先天遺傳的基礎上加上后天所得表現出的生理功能、心理健康和外部結構各方面綜合的、比較穩定的一種特質。在某些特殊情況下，體質決定著疾病的易感性[4]。在個人稟賦和外界環境的影響下, 不同個體有不同的癥狀表現, 而相對穩定的體質便會成為研究某些疾病異質性以及有效指導臨床的線索[5]。NAFLD 是受遺傳-環境-代謝應激相關因素影響的復雜疾病，其中與遺傳易感性關系密切。既往研究發現瘦素與單純性脂肪肝有關，其與瘦素受體(LEPR)結合, 在瘦素生物學作用的發揮中起重要作用[6]。脂聯素(ADIPOQ)是脂肪細胞分泌的活性蛋白之一，與糖、脂肪等代謝有著密切的關系，參與了腎臟疾病、肝臟疾病、胰島素抵抗等多種疾病發生、發展的機制[7,8]。既往研究發現NAFLD患者以痰濕質居多[9,10]，因此，本研究將對NAFLD痰濕質患者與LEPR基因以及ADIPOQ基因多態性進行關聯研究分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入人群為2018年4月至7月參與上海市浦東新區張江社區衛生服務中心常規體檢的常住居民。最終納入NAFLD患者461例，其中痰濕質組207例(男∶女=118∶89)，非痰濕質組254例(男∶女=101∶153)。每位參與者均測量了基礎指標(身高、體重、腰圍、臀圍和血壓等)以及生化指標(血常規、肝功能、腎功能、空腹血糖和血脂等)。本研究遵從上海中醫藥大學醫藥倫理委員會條例，每位參與者均簽訂知情同意書。

1.2 NAFLD診斷標準 NAFLD 的診斷標準采用中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組以及中國醫師協會脂肪性肝病專家委員會共同制訂的《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018 年更新版)》中的臨床診斷標準[11]?；颊呔蓛擅哂兄屑壱陨下毞Q的操作熟練的超聲科醫師采用彩色多普勒超聲進行診斷。

1.3 納入及排除標準 納入標準：①參與體檢、中醫問卷填寫以及進行基因分型者；②B超診斷為NAFLD者；③同意參加本研究并簽署知情同意書者；④年齡>65歲者。排除標準：①未參與體質問卷填寫者；②年齡<65歲者；③生化指標和體質問卷信息不完整及明顯有誤者；④未進行基因多態性分型者；⑤患有嚴重心腦肺腎疾病、惡性腫瘤以及拒絕填寫知情同意書者。

1.4 中醫體質診斷 體質診斷采用中華中醫藥學會頒布的體質分類法[12]。量表分為9個部分，由平和質和8種偏頗體質(陰虛質、陽虛質、氣虛質、痰濕質、濕熱質、血瘀質、氣郁質和特稟質)9個自評亞量表組成，共33道問題。每位調查員在問卷填寫之前經過統一化、規范化的填寫標準培訓并通過考核，調查時盡量做到術語表述一致，填寫時采取面對面的方式。為保證問卷信息的準確性，采用雙人雙錄入的方式。在每個體質得分的基礎上利用判別分析法判定每種體質[13]。

1.5 基因檢測方法 選用LEPR rs1805094、 rs11208659、 rs4655537、 rs12409877和ADIPOQ rs182052、 rs3774261、 rs6773957、 rs17366568這8個位點進行基因多態性分析。所有研究對象抽血前空腹10 h，于次日上午采外周靜脈血樣。采用苯酚-氯仿法進行基因組DNA提??；采用Sequenom 平臺的MassARRAY?分子量陣列技術對ADIPOQ和LEPR進行基因多態性分型，分型檢測均在上海交通大學Bio-X研究院的實驗平臺完成?；蚨鄳B性分型質量控制采用隨機抽取10%的DNA質量較高的樣本進行了重復分析。

1.6 統計學方法 采用 SPSS 25.0、SHEsis軟件和R語言進行數據分析。計量資料用均數±標準差表示；計數資料采用頻數(百分比)表示。計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。采用SHEsis軟件進行等位基因、基因型以及哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢驗。采用 logistic 回歸模型，多因素時校正年齡、性別、肝酶(谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶)以及血脂(高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、總膽固醇和甘油三酯)。分類變量具體賦值如下。因變量∶痰濕質=1，非痰濕質=0。自變量：LEPR rs11208659：CC=1，TC=2，TT=3；ADIPOQ rs182052: AA=1, AG=2, GG=3; 性別：男性=1，女性=2。連續性變量(高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶以及年齡)直接放入模型進行分析。按檢驗水準α=0.05，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 痰濕質組患者與非痰濕質組患者人口學特征和實驗室指標信息 見表1。性別和年齡在痰濕質患者和非痰濕質患者中具有顯著性差異，痰濕質患者年齡比非痰濕質患者平均高1歲；男性患者中痰濕質人數較非痰濕質人數多，而在女性患者中非痰濕質人數遠遠高于痰濕質人數。與非痰濕質患者相比，痰濕質患者BMI、腰圍、收縮壓、舒張壓均高于非痰濕質患者，高密度脂蛋白低于非痰濕質患者(P<0.05)。谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、低密度脂蛋白、總膽固醇和甘油三酯在兩組中均未見統計學差異。

表1 人口學特征和實驗室指標在兩組患者中的比較

2.2 ADIPOQ、LEPR等位基因和基因型頻率與痰濕質患者的相關性 見表2。LEPR rs1805094、rs11208659、rs4655537、rs12409877 和 ADIPOQ rs182052、rs3774261、rs6773957、rs17366568這8個位點在兩組患者中經吻合度檢驗，均符合哈迪-溫伯格法則，表明數據來自同一遺傳群體。經統計學分析，發現只有ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659 這兩個位點在兩組患者中存在顯著性差異。ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659位點等位基因頻率在兩組中均有差異，ADIPOQ rs182052 G等位基因在痰濕質患者中頻率高于非痰濕質患者，痰濕質患者LEPR rs11208659 T等位基因頻率顯著高于非痰濕質組。在基因型分析中，ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659位點在兩組患者中均有差異。ADIPOQ rs182052 位點GG基因型在痰濕質患者中的頻率分布高于非痰濕質患者，痰濕質患者的LEPR rs11208659位點TT基因型遠遠高于TC 基因型和CC基因型。

表2 ADIPOQ、LEPR等位基因和基因型頻率分析

2.3 NAFLD痰濕質患者Logistics回歸模型分析 見表3。單因素邏輯回歸分析發現ADIPOQ rs182052基因為痰濕質患者的危險因素。ADIPOQ rs182052 突變型GG基因攜帶者痰濕質發生的風險是非痰濕質發生風險的2倍[OR=2.104(1.24～3.578)]。進一步校正性別、年齡、肝酶以及血脂后，ADIPOQ rs182052 突變型GG基因攜帶者痰濕質發生的風險仍是非痰濕質發生風險的2倍[OR=2.274(1.303～3.967)]。表明ADIPOQ rs182052 野生型AA基因型是NAFLD痰濕質患者的保護基因。

表3 NAFLD痰濕質患者logistics回歸模型分析

2.4 痰濕質患者ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659的遺傳模型分析 見表4。

表4 ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659遺傳模型在兩組患者中的比較 [n(%)]

在5種遺傳模型中，ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659位點在共顯性模型、顯性模型以及加性模型中均存在統計學差異(P<0.05)。ADIPOQ rs182052在共顯性模型和顯性模型中，當以突變型GG基因型為參照時，AG和AA基因型為痰濕質患者的保護因素；LEPR rs11208659在顯性模型中，當以突變型TT基因型為參照時，發現TC和CC基因型為痰濕質患者的危險因素。NAFLD患者中C等位基因攜帶者痰濕質發生的風險是非痰濕質發生的2倍[OR=2.05(1.07～3.96)]。

3 討論

瘦素位于7號染色體q31.3位點，包含3個外顯子和2個內含子，由146個氨基酸組成，是分子量為16 kD的脂肪組織源性多肽激素[14]。LEPR屬于1類細胞因子受體家族，可在人體多種組織器官中表達。Wellhoener等[15]發現，葡萄糖代謝是機體瘦素表達和分泌的主要決定因素。而肝臟又是脂肪代謝和葡萄糖調節的重要臟器，瘦素參與肝內脂肪和葡萄糖代謝，通過增強葡萄糖-6磷酸激酶的活性，使得磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性增強，糖異生的效率增高，刺激肝糖原產生，而當LEPR位點發生突變時，瘦素在肝臟內的生物學效應不能正常發揮，致使葡萄糖-6磷酸激酶和PEPCK的活性降低，糖酵解活動增強，肝糖原減少，從而產生脂肪肝[16]。

ADIPOQ位于3號染色體q27.3，包含3個外顯子和2個內含子，由244個氨基酸組成，是分子量為30 kD的分泌蛋白。主要是由脂肪細胞產生的一種保護肝臟的細胞因子，與脂肪水平成負相關。NAFLD的“一次打擊學說”認為其產生的原因是胰島素抵抗(IR)，IR主要通過兩種機制增加肝細胞中脂肪的沉積-脂解作用和高胰島素血癥[17]。當機體出現IR時，胰島素作用減弱，脂肪迅速分解以及葡萄糖利用能力下降，致使機體產生脂肪代謝紊亂，血糖濃度代償性升高。而ADIPOQ可以增加胰島素敏感性，通過降低葡萄糖-6磷酸激酶和PEPCK的生物學活性，從而刺激糖異生過程，維持細胞內糖脂代謝的穩態。而當ADIPOQ位點突變時，其不能增加胰島素敏感性以及糾正機體的脂肪代謝紊亂，從而引發脂肪肝[18]。

NAFLD屬中醫“痞滿”、“濕阻”、“肝癖”等范疇。國醫大師李振華教授認為NAFLD病位在肝，病機關鍵在脾，屬痰飲為患[19]?！督饏T要略》有云：“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”。脾升胃降，為人體氣機之樞紐?！端貑枴れ`蘭秘典論》曰：“脾胃者, 倉廩之官, 五味出焉?！北狙芯咳巳壕鶠槔夏耆?，具有虛、痰、瘀、郁等生理特點，其中以虛為主。飲食不節、勞逸失調等導致脾失健運，水谷精微失于運化，化為痰飲，阻滯于肝及情志失調，肝氣郁結，肝失疏泄，氣滯血瘀，使得痰瘀互結，本病而生[20]。

本研究結果提示：①LEPRrs11208659位點為NAFLD痰濕質患者的危險因素，而ADIPOQrs182052位點為其保護基因；②ADIPOQ rs182052 野生型AA基因型為參照時，突變型GG基因型攜帶者痰濕質的發病風險為野生型AA基因型攜帶者的2倍。

本研究從分子生物學角度分析了LEPR(rs1805094、rs11208659、rs4655537、rs12409877)和ADIPOQ(rs182052、rs3774261、rs6773957、rs17366568)基因多態性與NAFLD痰濕質的相關性，初步揭示了ADIPOQ為NAFLD痰濕質患者的保護基因，ADIPOQ rs182052位點突變可能是NAFLD痰濕質患者的分子遺傳學基礎之一。本研究為NAFLD痰濕質患者的早期預防提供一定的數據支持。痰濕質是由于先天遺傳和后天嗜食肥甘厚膩，脾失健運，痰濕凝聚，以黏滯重濁為核心特征的體質[21]。體質具有后天可調性，因此中醫通過干預體質來早期預防疾病有著獨特的優勢，通過糾正或改善偏頗體質，降低疾病的易感性，可預防或延緩疾病的發生發展，降低社會醫療負擔。本研究尚存諸多不足，如患者為65歲以上老年人，且樣本量相對偏少，仍需后期擴大樣本量展開進一步研究。