黃瓜PP2-A1蛋白的生物信息學分析

龐寧寧 樊懷福 王哲

摘要：韌皮部蛋白2（PP2）是植物特異性的韌皮部蛋白，通過參與植物調控其細胞內基因表達水平和產物活性來應對自然界中的各種脅迫，對于維持植物株體形態、體內物質運轉和保護愈合植物傷口有重要意義。以前期克隆得到的黃瓜（Cucumis sativus）PP2-A1蛋白序列為對象，利用生物信息學方法，對黃瓜PP2-A1蛋白序列進行生物學功能分析。結果表明，黃瓜PP2-A1蛋白具有親水性，比較不穩定，半衰期短，無信號肽段，沒有跨膜結構，是定位在胞質的非分泌蛋白;結合對其二級結構和三級結構的預測分析，得出PP2-A1是以無規則卷曲和延伸鏈為主的片層結構;構建PP2的系統發育樹，發現其與香瓜親緣關系最近，同時預測其結構功能域，發現其具有1個典型的PP2結構功能域。

關鍵詞：黃瓜;PP2-A1蛋白;分子生物信息學;親水性;系統發育樹

中圖分類號： S642.201 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0046-03

韌皮部蛋白（phloem protein，PP）是從植物韌皮部汁液中提取出來的能特異性結合幾丁質的一種凝集素[1-2]，植物韌皮部蛋白是通過調控植物細胞內基因表達水平和產物活性來應對自然界中的各種脅迫參與到植物生命活動中，對于維持植物株體形態、內體物質的運轉和愈合植物傷口有著重要意義[3]。韌皮部蛋白2（PP2）是韌皮部汁液中最豐富、最神秘的蛋白質之一，韌皮部蛋白基因2在植物界的廣泛分布也表明它們在維管植物中是古老的、常見的[4]，它是一種二聚體幾丁質結合凝集素，能夠在同化物流中起轉運的作用，并且其中的凝集素活性或RNA結合特性可以在長距離上發揮功能[5-6]。由于篩管不能轉錄和翻譯，韌皮部蛋白質最可能在緊密連接的伴侶細胞中合成，并通過胞間連絲轉運到篩分元件中[7]。韌皮部液體的特異性蛋白質組成表明，這些蛋白質不僅對篩管維持，而且對于整個植物的生理和發育也起了重要的作用[8]。任何不同植物物種的蛋白質都可從成熟篩管的汁液中分離出來，但是迄今為止，僅有少數已確定其功能特征[9]。

Lee等使用FPLC凝膠過濾柱從熱處理的擬南芥幼苗的蛋白質提取物中提取了幾種韌皮部汁液蛋白，發現它們從功能上表征了PP2-A1基因，其編碼氨基酸也類似于韌皮部凝集素的蛋白質，利用細菌表達的AtPP2-A1重組蛋白，發現其具有雙重功能，即分子伴侶活性和抗真菌活性。在擬南芥防御系統中起著關鍵作用，能夠對抗各種外部脅迫，包括真菌病原侵襲和熱休克[10]。前期通過iTRAQ蛋白組學的方法研究了鹽脅迫對于黃瓜韌皮部滲出液蛋白質組的影響，發現在鹽脅迫條件下，黃瓜PP2-A1蛋白的表達量顯著上調，推測這可能是黃瓜韌皮部適應逆境脅迫的一種響應機制[11]。本研究通過分子生物信息學的方法，研究黃瓜PP2-A1蛋白序列的進化情況，并對黃瓜PP2-A1蛋白的理化特性、跨膜結構、信號肽、亞細胞定位情況和二、三級結構等進行分析，旨在了解黃瓜PP2-A1蛋白的基本特性，并預測它的功能，為進一步揭示PP2-A1基因的防御功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以前期克隆得到的黃瓜（Cucumis sativus）PP2-A1蛋白序列為對象，利用生物信息學方法，對黃瓜PP2-A1蛋白序列進行生物學功能分析。

1.2 方法

1.2.1 理化性質分析及疏水性結構預測 應用ExPAsY Protparam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）在線分析工具對黃瓜PP2-A1蛋白分子量（MW）、等電點（pI）等進行預測分析;利用在線軟件ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）預測黃瓜PP2-A1蛋白的疏水性結構。

1.2.2 亞細胞定位、信號肽以及跨膜結構預測 利用Signal IP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/performance.php）對黃瓜PP2-A1蛋白N-末端信號肽進行預測分析，利用SubLoc V1.0（https：//omictools.com/subloc-tool）對PP2-A1蛋白分析亞細胞定位情況;利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.biomedsearch.com/sci/TMHMM-server-v.html）預測PP2-A1蛋白跨膜結構。

1.2.3 糖基化位點預測及磷酸化位點預測 應用NetNGlyc1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和NetOGly4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）在線軟件分別對黃瓜PP2-A1蛋白的N-糖基化位點和O-糖基化位點進行分析預測。利用Net Phos 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）預測其磷酸化位點。

1.2.4 二、三級結構預測 利用ExPAsY SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）軟件對該蛋白質二級結構進行預測;使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/）軟件同源建模法預測目的蛋白三級結構。

1.2.5 系統進化樹 構建在線搜索美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫的BlastP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具，提交黃瓜PP2-A1蛋白序列，BLAST分析目的蛋白同源性序列，找出與黃瓜PP2-A1蛋白同源性高的蛋白序列，應用ClustalX程序對蛋白序列進行多序列比對，采用系統發育分子進化分析軟件MEGA（Ver.5.0），基于Neighbor-Joining distance（鄰近距離法）算法，利用Poisson correct modetionl構建系統進化樹[12]，研究黃瓜PP2-A1蛋白序列發育情況。

1.2.6 結構域及功能位點預測 應用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/help/smart_glossary.shtml）在線提交PP2-A1蛋白的氨基酸序列，對其蛋白結構功能域的功能位點進行預測。

2 結果與分析

2.1 黃瓜PP2-A1蛋白的理化性質分析及疏水性結構預測

用ProtParam預測分析黃瓜PP2-A1蛋白的理化性質，分析結果顯示，黃瓜PP2-A1蛋白含154個氨基酸，預測分子量為17 540.9 u，理論等電點（pI）為7.76，正電荷殘基數為13個，負電荷殘基數為12個，總共包含2 419個原子，分子式為 C787H1 183N223O218S8，黃瓜PP2-A1蛋白的不穩定指數為46.78（>45為不穩定），堿性氨基酸賴氨酸含量較高，此蛋白呈弱堿性。蛋白的總平均親水性為-0.184，說明蛋白為不穩定弱堿性親水蛋白。用在線軟件ProtScale預測分析PP2-A1蛋白的疏水性結構，分析結果見圖1，親水性/疏水性最小值為-2.456，最大值為1.344，總體表現為親水性。這與之前的分析相互驗證。

2.2 黃瓜PP2-A1蛋白的亞細胞定位、信號肽以及跨膜結構分析

典型的跨膜螺旋區主要是由20～30個疏水性氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸等）組成;親水殘基往往出現在疏水殘基之間，對蛋白質功能有重要的作用。用在線軟件TMHMM Server v. 2.0基于HMM方法的蛋白質跨膜區預測工具，分析黃瓜韌皮部基因編碼的蛋白跨膜結構，結果顯示該基因編碼的蛋白不存在跨膜結構，不可能是膜上的受體或定位于膜上。用在線軟件SignalP4.0分析黃瓜凝集素PP2-A1蛋白，最后的計算結果為“NO”，表明該基因編碼的蛋白無信號肽。通過在線軟件SubLocV1.0對蛋白質亞細胞進行定位，分析發現，該蛋白可能存在于細胞周質中。

2.3 黃瓜PP2-A1蛋白的糖基化位點預測及磷酸化位點預測

N-糖基化是指糖鏈通過N-乙酰葡萄糖胺連接到蛋白質上保守序列N-X-S/T中的天冬酰胺的氨基側鏈上[13]，結果如圖2所示，利用NetNGlyc軟件對其N-糖基化位點分析可知，黃瓜PP2-A1蛋白可能有2個N-糖基化位點，分別為第21、第77位的天冬酰胺殘基，因此黃瓜PP2-A1蛋白應該具有N-糖基化機制，用NetOGlyc分析軟件對黃瓜PP2-A1蛋白的O-糖基化位點預測，結果表明黃瓜PP2-A1蛋白沒有潛在的O-連接糖基化位點。對黃瓜PP2-A1蛋白的磷酸化位點分析發現（圖3），目的蛋白有4個絲氨酸位點、4個蘇氨酸位點、1個酪氨酸位點。

2.4 黃瓜PP2-A1蛋白的二級結構預測分析

PP2-A1蛋白的二級結構預測分析結果如圖4所示，圖中由短至長的豎線依次為無規則卷曲、β轉角、延伸鏈、α螺旋。結果顯示，該蛋白包含43.51%無規則卷曲（random coil）、35.70%延伸鏈（extended strand）、13.64α螺旋（alpha helix）、7.14%β轉角（beta turn）。因此，黃瓜PP2-A1蛋白的二級結構中多為無規則卷曲和片層結構。

2.5 黃瓜PP2-A1蛋白的三級結構預測分析

用Phyre2在線軟件預測黃瓜PP2-A1蛋白的三級結構，獲得的黃瓜韌皮部凝集素的3D模型如圖5所示，與二級結構的分析結果一致，該蛋白主要由無規則卷曲、延伸鏈和α螺旋組成。

2.6 構建黃瓜PP2-A1蛋白的系統進化樹

利用NCBI網站Blastp比對黃瓜PP2-A1蛋白的同源序列，下載與PP2-A1蛋白相似性較高的甜瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbita moschata）、筍瓜（Cucurbita maxima）等物種的氨基酸序列，使用ClustalX2.1軟件對黃瓜PP2-A1蛋白序列進行多序列對比。運用MEGA5.0軟件構建基于PP2家族不同氨基酸序列的進化樹，結果如圖6所示，可以看出黃瓜

（Cucumis sativus）PP2蛋白與甜瓜PP2蛋白在同一分枝上聚為同一類，相似性為68.18%，說明甜瓜與其親緣性較近;其與另一個分枝上的葫蘆科南瓜屬的日本南瓜（Cucurbita argyrosperma）相似性為27.93%，與筍瓜和金瓜（Cucurbita digitata）的相似性同為27.80%，與南瓜的相似性為25.68%。

2.7 黃瓜PP2-A1蛋白的結構域及功能位點預測

根據SMART分析結果顯示，該蛋白具有一個典型的韌皮部蛋白2功能結構域，在該序列的氨基酸位置為12～153;對其編碼蛋白的功能位點進行預測，發現該序列包含3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、1個N-豆蔻?；稽c、1個蛋白激酶C磷酸化位點、2個N-糖基化位點（表1）。

3 討論與結論

基于生物信息學的角度，利用分子生物信息學各種相關軟件的手段，分析黃瓜PP2-A1蛋白序列的生物學特征，發現該蛋白是由20種氨基酸組成的一種不穩定的親水性蛋白質，對PP2-A1蛋白的信號肽、跨膜結構和亞細胞定位分析，發現其不具備信號肽段，沒有跨膜結構，并且在膜內定位的概率幾乎為0，故該蛋白質為非分泌非跨膜的膜外（胞質）蛋白質。分析其二級結構，發現該基因編碼蛋白質中無規則卷曲和延伸鏈所占的比重較大，結合對其三級結構的預測，證實了該蛋白質的肽鏈主要以無規則卷曲和延伸鏈為主。有研究表明，無規則卷曲經常構成酶活性部位和特異性功能部位[14]，而研究表明來自葫蘆科的韌皮部蛋白2是一種表達量很高的韌皮部蛋白，其mRNA高度保守且具有韌皮部組織特異性，并且能在植物體受到侵害時發生韌皮部防衛反應，對于抵抗外界環境中生物以及非生物脅迫具有重要作用[15]。并且由在線軟件分析得出，黃瓜PP2-A1基因編碼的蛋白含有N-糖基化位點，前人研究也表明，韌皮部蛋白2（PP2）是一種優先特異結合N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體的、大小為49 ku亞基的二聚體蛋白。經過對黃瓜PP2-A1蛋白的同源性分析發現，黃瓜與甜瓜的親緣關系比較近，與南瓜屬的日本南瓜、筍瓜等比較接近，這與植物傳統分類表上的分類關系基本一致。同時分析其結構功能域時發現，在12～153有1個典型的PP2（韌皮部蛋白2）功能域，表明該基因是PP2基因家族的一個成員。

總之，本研究從生物信息學角度，以黃瓜PP2-A1基因編碼的蛋白為分析對象，對PP2-A1基因推導的氨基酸序列結構特征進行分析，同時對其整個肽鏈的理化性質、疏水性、信號肽、跨膜結構和亞細胞定位、糖基化位點、磷酸化位點及其二、三級結構特征等進行預測分析，并構建黃瓜韌皮部蛋白親緣關系的進化樹，同時也對黃瓜PP2-A1蛋白的結構域及功能位點進行預測，為進一步研究蛋白質的高級結構及探尋黃瓜PP2-A1基因的潛在功能提供參考。利用分子生物信息學手段，基于已獲得的黃瓜韌皮部蛋白編碼信息，對黃瓜韌皮部蛋白進行結構、特征及親緣關系分析，可增進對黃瓜韌皮部蛋白的認識，利于從分子水平上解釋和挖掘黃瓜韌皮部蛋白的生物功能，為后續研究黃瓜PP2-A1基因試驗奠定基礎。

參考文獻：

[1]王述民，李立會，黎 裕，等. 中國糧食和農業植物遺傳資源狀況報告（Ⅱ）[J]. 植物遺傳資源學報，2011，12（2）：167-177.

[2]Aoki K，Suzui N，Fujimaki S，et al. Destination-selective long-distance movement of phloem proteins[J]. Plant Cell，2005，17（6）：1801-1814.

[3]馬 靜，王 楓，侯喜林，等. 芹菜韌皮部蛋白基因的分離與表達分析[J]. 植物遺傳資源學報，2013，14（3）：523-529.

[4]Dinant S，Clark A M，Zhu Y M，et al. Diversity of the superfamily of phloem lectins （phloem protein 2） in angiosperms[J]. Plant Physiology，2003，131（1）：114-128.

[5]Kehr J，Buhtz A. Long distance transport and movement of RNA through the phloem[J]. Journal of Experimental Botany，2008，59（1）：85-92.

[6]Srinivasan K，Roy S，Washburn N A，et al. A quantitative microtiter assay for sialylated glycoform analyses using lectin complexes[J]. Journal of Biomolecular Screening，2015，20（6）：768-778.

[7]Froelich D R，Mullendore D L，Jensen K H，et al. Phloem ultrastructure and pressure flow：Sieve-Element-Occlusion-Related agglomerations do not affect translocation[J]. Plant Cell，2011，23（12）：4428-4445.

[8]Carella P，Merl-Pham J，Wilson D C，et al. Comparative proteomics analysis of phloem exudates collected during the induction of systemic acquired resistance[J]. Plant Physiology，2016，171（2）：1495-1510.

[9]Lemoine R，La Camera S，Atanassova R，et al. Source-to-sink

transport of sugar and regulation by environmental factors[J]. Frontiers in Plant Science，2013，4：272.

[10]Lee J R，Boltz K A，Lee S Y. Molecular chaperone function of Arabidopsis thaliana phloem protein 2-A1，encodes a protein similar to phloem lectin[J]. Biochemical&Biophysical Research Communications，2014，443（1）：18-21.

[11]Ding D，Xiao Z X，Xiao H L，et al. Revelation of the early responses of salt tolerance in maize via SSH libraries[J]. Genes & Genomics，2012，34（3）：265-273.

[12]Beneteau J，Renard D，Marche L，et al. Binding properties of the N-acetylglucosamine and high-mannose N-glycan PP2-A1 phloem lectin in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2010，153（3）：1345-1361.

[13]Li X，Yang Y Q，Ma L，et al. Comparative proteomics analyses of Kobresia pygmaea adaptation to environment along an elevational gradient on the central Tibetan Plateau[J]. PLoS One，2014，9（6）：e98410.

[14]Pallas V，Gomez G. Phloem RNA-binding proteins as potential components of the long-distance RNA transport system[J]. Frontiers in Plant Science，2013，4：1-6.

[15]Gómez G，Pallás V. Identification of an in vitro ribonucleoprotein complex between a viroid RNA and a phloem protein from cucumber plants[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2001，14（7）：910-913.