兒童結核性腦膜炎腦脊液蛋白質差異比較性研究

龔厚武 李玉飛＊

長沙醫學院基礎醫學院 湖南長沙 410219

在全球范圍內，結核性腦膜炎在肺結核中占有很大比例，其發病率和病死率均很高，尤其是在患兒和HIV 感染患者中[1]。而結核性腦膜炎(結腦)又是結核病的最嚴重類型，且兒童易感，但由于結腦早期臨床表現特異性差，常被誤診為隱球菌性腦膜炎、化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎等疾病而延誤治療。其誤診率高達31.6～50%，而早期(一周內)診斷率僅為10%[2]。兒童結腦患者由于難以得到較多量的CSF，其結腦的診斷更為困難，使其預后更差。因此，尋找一種新的快速的診斷結核性腦膜炎的方法是目前臨床上亟待解決的問題。

1 資料與方法

1.1 腦脊液收集

正常兒童CSF 標本來自外科需要腰麻的手術兒童，所有患兒均無神經系統受累表現，結腦患兒CSF 抗酸染色陽性，或者結核菌培養陽性。標本收集量：4ml。標本保存：所有標本加入蛋白酶抑制劑80μL（sigma），-70℃保存待檢。

1.2 腦脊液樣品制備

包括蛋白提取和蛋白定量。

1.3 雙向凝膠電泳

分別取總蛋白質700μg 與水化液充分混合，使總體積達到450μl，在IPGphor 等電聚焦儀上進行等電聚焦，電泳條件為每膠2.5W 恒流電泳30min 后，改用每膠11W 恒流電泳至溴酚藍離膠底緣約1mm 處停止電泳。

1.4 硝酸銀染色

主要參照蛋白質銀染試劑盒操作說明。將凝膠小心取下，固定液中過夜；敏化液中30min；蒸餾水洗滌3 次，每次5min；銀染液中20min；蒸餾水洗滌2 次，每次1min；顯影液中至剛好能看到所有的蛋白質斑點；終止液中10min；蒸餾水洗滌3 次，每次5min；保存液中至掃描。

1.5 圖像分析

通過Imagescanner 掃描儀以及LabScan 掃描軟件對凝膠進行掃描獲取圖像，借助圖像分析軟件PDQuest 7.0 進行詳細分析，比較蛋白質斑點差異。以正?；純篊SF 的2-DE 凝膠為參考膠，將結腦患兒CSF 的凝膠與之進行比較。根據斑點的位置、大小、形狀等參數，軟件自動將不同圖譜中的相同蛋白質點匹配。不能匹配的蛋白質斑點（升高或降低200%）視為差異點。

1.6 MALD-TOF-MS

將制備好的點樣板置于Applied Biosystems Voyager System 4307 MALDI-TOF-MS 儀上進行分析，采用反射模式，正離子譜測定，離子源加速電壓為20000V，反射電壓比為1.12，N2 激光波長337nm，脈沖寬度為3 ns，離子延遲提取100ns，真空度4×10-7Torr，質譜信號單次掃描累加50 次，質譜使用胰蛋白酶自動降解離子峰作為內部標準校正，獲取了肽質量指紋圖。

1.7 Database 搜索

應用在線軟件Mascot Distiller（http://www.matrixscience.com）進行搜索。鑒定結腦患兒CSF 中結核相關的特異性蛋白質分子。

1.8 Western Blot 固相化蛋白質免疫學檢測證實

取50 ul 蛋白質樣品，在變性聚丙烯酰胺凝膠中垂直板電泳。用水平電泳槽將凝膠進行電轉移，將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上?？逻_X 光膠片感光后自動洗片。VDS 圖像分析系統進行顯影條帶分析。Western 印跡法可檢測出1-5ng 的待檢蛋白。

1.9 技術合成結核特異性蛋白質抗體，制備結腦特異性蛋白質診斷芯片。

2 結果

正常組與TM 組CSF 2-DE 圖譜見圖表1，實驗中共選出個20 個差異蛋白質點進行分析，獲得了20 張肽質量指紋圖譜。軟件識別其有效肽片斷峰后查詢數據庫，搜索后匹配到蛋白質的點有16 個，其中有4 對蛋白質點為同一物質分別為2 號、25 號載脂蛋白A-I，4 號、5 號免疫球蛋白J 鏈，7 號、9 號免疫球蛋白γ 輕鏈VLJ 區，3 號、6 號單克隆免疫球蛋白M 冷凝素。

3 結論

對比結腦患兒和正常兒童的腦脊液蛋白質組圖譜發現多處結核性腦膜炎特異性蛋白，診斷時使用結腦特異性蛋白質診斷芯片，通過分析腦脊液蛋白組圖譜提高確診結核性腦膜炎的速度和準確性可行。

4 討論

TBM 是由TB 感染所導致發病的中樞神經系統感染性疾病，其由TB 透過血腦屏障引起軟腦膜、蛛網膜和腦實質等的中樞神經系統的非化膿性炎癥，為臨床上常見的肺外結核病中的最嚴重類型[3]?；冀Y核性腦膜炎，腦實質、腦血管、脊髓膜也常受累，多發生于兒童及青少年，TBM 臨床多表現為發熱、嘔吐、抽搐、腦神經損害及昏迷等，臨床上常采用腦脊液抗酸染色、結核菌培養、結核桿菌核酸擴增方法尋找病原學依據[4]。涂片僅能對含菌量大于10，00 個/ml 的標本表現出較高的敏感性而培養則需4-6 或8 周的時間，另外化療所產生的培養時間的延長、低活力菌和型等非桿菌結構的生物學性狀的改變更增加了培養的局限性[5]。

中樞神經系統疾病能夠顯著影響CSF 中蛋白質的濃度以及蛋白質存在的表達。大量的研究證明了人CSF 中的蛋白質及多肽在濃度及結構等方面的變化也能反映中樞神經系統感染的病理生理信息，是一個被忽略的、有待開發的寶庫，可被用于尋找發病機制的目標蛋白、早期診斷的生物標記物。CSF 蛋白質成分的改變揭示了中樞神經系統疾病的病理生理過程和分子發病機制，是目前神經系統疾病研究的熱點之一[6]CSF 在于蛛網膜下腔，環繞著腦和脊髓，主要由脈絡叢、室管膜分泌產生。包括小分子物質、鹽、肽類、蛋白質和酶，他們在生理過程中發揮著重要作用。CSF 蛋白質存在模式和濃度的改變可以精確反映中樞神經系統疾病的病理過程[7]，通過CSF 蛋白質組學研究，為各種中樞神經疾病提供了。由疾病特異性蛋白（disease specific proteins， DSPs）制備的結腦特異性蛋白質診斷芯片用于診斷，較常規抗酸染色法更高效、更靈敏。

圖表1