甘薯種質資源遺傳多樣性的ISSR分析

劉中華 林志堅 李華偉 許泳清 李國良 邱永祥 邱思鑫 湯浩

摘要：【目的】利用ISSR分子標記分析不同類型甘薯種質的遺傳多樣性，為甘薯種質資源的傳播途徑分析、分類鑒定、有效利用及雜交親本選擇等提供參考依據?！痉椒ā繌?00條ISSR引物中篩選出多態性好、擴增條帶清晰且重復性好的ISSR引物，利用其對129份甘薯種質材料進行擴增，通過DPS 7.05計算不同種質間的遺傳距離，并采用非加權配對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析?！窘Y果】以篩選獲得的20條ISSR引物對129份甘薯種質材料進行擴增，共獲得232條條帶，其中多態性條帶230條，多態性條帶比例達99.14%，平均每條ISSR引物擴增出11.60條條帶?；贗SSR分子標記的5份野生種平均遺傳距離為0.4637，124份甘薯栽培種平均遺傳距離為0.1805。野生種與地方品種、引進品種和育成品種間的平均遺傳距離分別為0.4688、0.4618和0.4643;而在124份栽培種中，地方品種與引進品種間的平均遺傳距離最大（0.2024），引進品種與育成品種間的平均遺傳距離最?。?.1673），地方品種與育成品種間的平均遺傳距離為0.1978。聚類分析結果表明，當在遺傳距離為0.3200時可將野生種與栽培種完全區分開;5份野生種在遺傳距離為0.3200時又被劃分為4個類別;124份栽培種在遺傳距離為0.2000時可劃分為6個類別，其中，新種花、福菜薯18號和黃皮9號3個品種各自單獨組成一個類群（第Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ類），金山57、豫薯8號和瑞薯1號組成第Ⅲ類;第Ⅳ類包含93個地方品種和育成品種;第Ⅵ類由25個地方品種和育成品種組成?！窘Y論】不同類型和不同來源地的甘薯種質資源間存在較大遺傳差異，以野生種與栽培種間的遺傳差異最大，而栽培種間又以地方品種和引進品種間差異較大，即地方品種資源在我國甘薯育種親本選擇利用方面還具有很大的應用潛力。ISSR分子標記是一種適用于甘薯資源遺傳多樣性分析的理想分子標記。

關鍵詞： 甘薯;種質資源;ISSR分子標記;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號： S531.024? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）11-2392-09

Genetic diversity analysis of sweetpotato [Ipomoea batatas（L.） Lam.] by ISSR molecular markers

LIU Zhong-hua， LIN Zhi-jian， LI Hua-wei， XU Yong-qing， LI Guo-liang，

QIU Yong-xiang， QIU Si-xin*， TANG Hao*

（Crops Research Institute， Fujian Academy of Agriculture Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Tuber and Root Crops in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs ， Fuzhou? 350013， China）

Abstract：【Objective】In order to provide a theoretical basis for analysis of the domestication pathways， classification and identification， effective utilization and selection of hybrid parents of sweet potato germplasm， the ISSR molecular markers were used to analyze the genetic diversity of different types of sweet potato. 【Method】ISSR primers with rich polymorphism， clear amplified bands and good repeatability were screened out from 100 primers. The DNA of 129 sweet potato accessions were amplified by the selected ISSR primers， and amplified bands were analyzed. The genetic distances among various varieties were calculated using DPS 7.05， and the cluster analysis was performed using the un-weighted pair-group arithmetical mean method（UPGMA）. 【Result】The results showed that∶232 bands were amplified by 20 polymorphic ISSR primers selected from 100， of which 230 were polymorphic bands， with a polymorphic ratio of 99.14%， and the average bands amplified by each primer were 11.60. The average genetic distance of five wild species based on ISSR marker was 0.4637， which among 124 sweet potato cultivars was 0.1805. The average genetic distance between wild varieties and local varieties， between wild varieties and introduced varieties and wild varieties and bred varieties were 0.4688， 0.4618 and 0.4643. Among all 124 cultivars， the average genetic distance between local accessions and the introduced varieties was the largest（0.2024）， while which between the introduced varieties and the bred varieties was the smallest（0.1673）. The average genetic distance between local accessions and bred cultivars was 0.1978. The results of cluster analysis showed that wild species were completely distinguished from cultivars when the genetic distance was 0.3200. Furthermore， five wild species were divided into four categories at this level， while 124 cultivars were divided into 6 categories at the level of 0.2000. Among them， Xinzhonghua， Fucaishu No.18 and Huangpi No.9 were in three single groups（Categories I， II， and V） separately， and Jinshan 57， Yushu No.8 and Ruishu No.1 were classified in group III. Meanwhile， Group IV contained 93 local accessions and bred cultivars， and group VI consisted of 25 local accessions and bred cultivars. 【Conclusion】There are wide genetic differences between different types and different sources of sweet potato germplasm. The genetic difference between wild species and cultivars is the largest. Among cultivars， the differences between local accessions and introduced cultivars are larger than others. That means local accessions have great application potential for the selection and utilization of breeding parents of sweet potato in China. ISSR molecular marker is an ideal molecular marker suitable for analysis of genetic diversity of sweet potato germplasm.

Key words： sweet potato; germplasm resources; ISSR molecular marker; genetic diversity; cluster analysis

0 引言

【研究意義】甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]是世界上重要的糧食、飼料、工業原料及新型能源作物，也是世界七大作物之一，我國甘薯產量占世界總產量的67.3%（蘇一鈞等，2018）。甘薯在我國已有400多年的種植歷史，且地方品種層出不窮（范澤民，2015）。雖然我國甘薯育種已取得長足進展，處于世界先進水平（張立明等，2003;馬代夫等，2005），但甘薯育種的種間遺傳背景狹窄（賀學勤等，2005），其親本集中在少數品種之間，非常不利于甘薯品種的遺傳改良（吳覲宇等，2009）。因此，利用分子標記技術開展甘薯種質的遺傳多樣性分析，明確各類種質間的遺傳背景、加強親本選配等，對推進甘薯育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】ISSR分子標記兼具RAPD和SSR分子標記的優點，現已廣泛應用于生物品種鑒定（Culley and Wolfe，2001;趙謙等，2007）、遺傳圖譜構建（易克等，2003）、基因定位（李冬梅，2016）及遺傳多樣性分析（朱巖芳等，2010;張盾等，2018;閆林等，2019）等領域。賀學勤等（2005）利用RAPD、ISSR和AFLP分子標記對系譜關系明確的7個甘薯品種進行親緣關系分析，結果發現基于ISSR分子標記得到的聚類圖與系譜圖最吻合，因此認為ISSR分子標記更適于分析甘薯品種的親緣關系。郝玉民等（2007）利用SRAP分子標記對36份甘薯品種進行DNA多態性分析，結果表明所選材料間具有較高的遺傳相似度。吳潔等（2007）利用SRAP分子標記對四川省86份甘薯品種親緣關系進行分析，結果證實四川省育成的甘薯品種資源遺傳范圍較狹窄。李強等（2008，2009）利用ISSR和AFLP分子標記分析我國62份甘薯主要親本和26份主要育成品種的遺傳多樣性以明確其遺傳差異，結果顯示我國甘薯育成品種遺傳基礎狹窄的局面尚未得到改觀。陳新起等（2009）利用ISSR分子標記分析10個菜用甘薯材料的遺傳多樣性和親緣關系，結果顯示菜用甘薯材料的遺傳差異較明顯。吳覲宇等（2009）對25份美國甘薯品系及我國47份甘薯種質資源進行ISSR多態性分析，結果表明美國甘薯育種材料遺傳多樣性較高，可將其應用到國內甘薯育種中以擴大遺傳背景。宋吉軒等（2011，2017）利用ISSR分子標記分析貴州甘薯地方品種資源和紫心甘薯種質的遺傳多樣性，結果發現23份貴州紫心甘薯種質資源間的親緣關系較近。季志仙等（2014）選用6個ISSR分子標記對l7份甘薯品種進行DNA指紋擴增，結果表明甘薯主要食用品種間具有較好的遺傳多樣性，但同類型品種間又具有較高的遺傳相似性，即這類品種需要引進或創制新資源。趙冬蘭等（2015）利用形態農藝性狀標記對來自17個省份的176份我國甘薯地方種質資源進行遺傳多樣性分析，結果發現形態標記并未按照這些地方種質的來源地進行聚類。劉中華等（2018）采用SRAP分子標記對129份甘薯種質進行遺傳多樣性和起源演化分析，結果證實SRAP分子標記可有效應用于甘薯遺傳多樣性及其起源與演化分析?！颈狙芯壳腥朦c】至今，鮮見利用ISSR分子標記同時對野生資源、地方品種、引進品種和育成品種等4類甘薯種質開展遺傳多樣性分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】利用ISSR分子標記分析129份不同類型甘薯種質的遺傳多樣性，以期為甘薯種質資源的傳播途徑分析、分類鑒定、有效利用及雜交親本選擇等提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料包含野生種、地方品種、引進品種和育成品種等4類129種甘薯種質（表1），均種植于福建省農業科學院作物所薯類作物種質資源圃內。ISSR引物、瓊脂糖和40%丙烯酰胺溶液購自生工生物工程（上海）股份有限公司;PCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司;DL2000 DNA Marker購自貴州彌勒天根生物科技有限公司。主要儀器設備：垂直電泳槽（DYCZ-24A，北京六一有限公司）、移液器（Eppendorf，德國）、Veriti 96well PCR儀（ABI，美國）、離心機（Eppendorf，德國）、-80 ℃超低溫冰箱（SANYO，日本）、水平電泳槽（DYCZ-22A，北京六一有限公司）和Nanodrop2000C超微量分光光度計（Thermo，美國）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 甘薯基因組DNA提取 采用改進后的甘薯基因組DNA高效快速提取方法（李強等，2007）提取甘薯鮮幼嫩葉片總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并以Nanodrop2000C超微量分光光度計測定DNA濃度，-20 ℃保存備用。

1. 2. 2 ISSR引物篩選 利用8份材料的基因組DNA從100條ISSR引物中篩選出重復性好、條帶清晰、多態性豐富，且擴增條帶（100～1000 bp）數目較多（不少于5條）的引物進行正式擴增。

1. 2. 3 PCR擴增 PCR反應體系20.0 μL：ISSR引物2.0 μL，DNA模板2.0 μL，PCR SuperMix（含DNA Polymerase和dNTPs的反應緩沖液）10.0 μL，蒸餾水6.0 μL。擴增程序參照宋吉軒等（2009，2010）的方法，即95 ℃預變性5 min;95 ℃ 45 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行41個循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物以8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓130 V，功率4 W，時間90 min）進行分離檢測后，采用銀染法（固定→銀染→顯色）進行染色，最后觀察并拍照。

1. 3 統計分析

應用DPS 7.05對擴增條帶的有無進行計數，當某一擴增條帶出現時賦值為“1”，不存在時賦值為“0”，從而將圖形資料轉換成數據資料，計算不同種質間的遺傳距離（Genetic distance，GD），然后采用非加權配對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析。

GD=-ln[2Nij/（Ni+Nj）]

式中，Ni表示種質i的條帶數目，Nj表示種質j的條帶數目，Nij表示種質i和種質j共有的條帶數目。

2 結果與分析

2. 1 ISSR引物篩選及擴增結果

利用8份材料的基因組DNA分別對100條ISSR引物進行多態性篩選，結果篩選出20條多態性好、擴增條帶清晰且重復性好的ISSR引物（表2和圖1）;利用篩選獲得的20條ISSR引物對129份甘薯種質材料進行擴增，共獲得232條條帶，其中多態性條帶230條，多態性條帶比例達99.14%，平均每條ISSR引物擴增出11.60條條帶。引物UBC811的多態性最高，能擴增出16條條帶（圖2）。

2. 2 聚類分析結果

基于ISSR分子標記的5份野生種平均遺傳距離為0.4637，124份甘薯栽培種平均遺傳距離為0.1805。其中，84份育成品種的平均遺傳距離為0.1670，28份地方品種的平均遺傳距離為0.1968;12份引進品種的平均遺傳距離為0.1791。由圖3可看出，當遺傳距離按0.3200（線L1）劃分時，能將5份野生種與124份栽培種完全區分開;5份野生種在遺傳距離為0.3200時又被劃分為4個類別：來自澳大利亞的二倍體I. quamoclit單獨歸為一類;來自委內瑞拉的二倍體材料I. trifida和來自多米尼加的二倍體材料I. triloba歸為一類;來自巴西的二倍體材料I. setosa和來自巴拉圭的二倍體材料I. nil分別歸為一類。124份甘薯栽培種在遺傳距離為0.2000（線L2）時可劃分為2個大類、4個小類共計6個類別，其中，新種花、福菜薯18號和黃皮9號3個品種各自單獨組成一個類群，分別為第Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ類;金山57、豫薯8號和瑞薯1號組成第Ⅲ類;第Ⅳ類包含93個地方品種和育成品種;第Ⅵ類由25個地方品種和育成品種組成。

124份栽培種中，新種花在自然條件下極難開花，難以有效地與其他品種進行傳粉、結實并形成后代，其單獨聚為一類為第Ⅰ類，與其他品種的遺傳距離較遠;第Ⅱ類的福菜薯18號是一個葉菜專用型品種，其親本材料以福建和臺灣的葉菜型品種為主;金山57、豫薯8號和瑞薯1號3個品種組成第Ⅲ類，發現這3個品種中均具有來自廣東甘薯品種的遺傳背景;湘薯75-55、濟薯20和巖高糖等93個品種組成第Ⅳ類，其幾乎涵蓋了大部分來源的甘薯品種，日本、美國和菲律賓等地區的引入品種均聚類在此類中，其中，來自菲律賓的2個品種DaJa和Kccane分別與我國福建和臺灣地區的品種烏骨仔和臺農63聚在一起;黃皮9號單獨聚為一類（第Ⅴ類）;廣薯87、徐28、徐紫薯2號等25個品種聚在一類（第Ⅵ類），此類甘薯主要為來源于福建、廣東的地方品種和育成品種，少數來自山東、河北和江蘇等地，另有一個引自日本的品種——勝利百號。經聚類分析發現，我國福建地方品種烏骨仔與菲律賓引進品種DaJa的遺傳距離僅為0.0333，另外，臺農63與來自菲律賓的Kccane也聚在一起，遺傳距離只有0.1147。

2. 3 遺傳距離分析結果

ISSR數據經DPS 7.05分析發現野生種與地方品種、引進品種和育成品種間的平均遺傳距離分別為0.4688、0.4618和0.4643（表3），其中，野生種與我國地方品種間的平均遺傳距離最大，與引進品種間的平均遺傳距離最小。此外，引進品種與地方品種間的平均遺傳距離為0.2024，育成品種與地方品種間的平均遺傳距離為0.1978，引進品種與育成品種間的平均遺傳距離為0.1673，說明我國地方品種在品種選育過程中應用的頻率和范圍較小，而引進品種在育種親本選擇時占比相對較高，因此導致地方品種與育成品種間的親緣關系較遠、遺傳距離較大?？梢?，地方品種在我國甘薯育種中還具有很大的應用潛力。

通過對不同來源地甘薯種質的平均遺傳距離進行比較分析，結果（表4）發現不同地區間的甘薯種質平均遺傳距離差異較大，其中，中國大陸品種與尼日利亞品種的平均遺傳距離最遠（0.2127），而與中國臺灣品種的平均遺傳距離最近（0.1357），與菲律賓品種和日本品種間的平均遺傳距離分別為0.1989和0.1905，與美國、秘魯和巴西等美洲品種間的平均遺傳距離也相對較低（0.1529～0.1794）?？梢?，中國大陸的甘薯種質與非洲種質差異較大，存在親本選擇利用的潛力，其次是菲律賓和日本的甘薯種質也具有一定的雜交利用潛力。此外，中國大陸品種間的平均遺傳距離在0.0492～0.4583，變幅最大，說明我國的甘薯種質利用潛力十分巨大，特別是地方品種與育成品種間應充分發掘利用，加大親本選擇力度，創制優勢雜交組合，選擇優勢后代。

3 討論

ISSR分子標記在引物設計上較SSR分子標記更簡單，不需要知道DNA序列即可使用引物進行擴增，且能揭示比RFLP、RAPD和SSR分子標記更豐富的多態性，現已廣泛應用于遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性及系統發育等研究領域（王建波，2002;趙謙等，2007;李強等，2008）。本研究采用ISSR分子標記開展甘薯種質資源遺傳多樣性分析，結果發現124份栽培種的平均遺傳距離為0.1805（最大為0.4583，最小為0.0492），即育成品種間的遺傳距離較近，說明我國甘薯育成品種間遺傳基礎狹窄，與前人的研究結果（賀學勤等，2005;李強等，2009;趙冬蘭等，2015）一致。此外，本研究中的甘薯品種紅姑娘與東興紅姑娘間的遺傳距離為0.2364，雖然名字相近但遺傳距離較遠，與本課題組前期基于SRAP分子標記的分析結果（劉中華等，2018）一致。與SRAP分子標記分析的甘薯遺傳多樣性相比，基于ISSR分子標記的遺傳距離變幅更大，更適合用于甘薯遺傳多樣性分析。在本研究的129份甘薯種質材料中，二倍體野生種I. quamoclit與育成品種杭香1號間的遺傳距離最大，達0.6327，表明甘薯野生種與栽培種間存在較大差異，也說明ISSR分子標記是評價甘薯遺傳多樣性的有效途徑之一，且檢測效率高。

本研究發現甘薯野生種與栽培種間存在著豐富的遺傳多樣性，因此可利用野生種中的某些優異基因對栽培種加以改良利用（曹清河等，2009）。在栽培種內，引進品種、地方品種和育成品種間的遺傳距離與其來源地關系不明顯，主要影響因素是其血緣關系和遺傳背景，與前人的研究結果（趙冬蘭等，2015;羅凱等，2016;鄧吉良等，2018）一致。不同類型、不同來源地的甘薯種質遺傳距離差異也不同。本研究結果表明，相對于引進品種和育成品種，地方品種的遺傳多樣性更豐富，具體表現為中國大陸品種與來自非洲尼日利亞及亞洲菲律賓和日本的品種遺傳距離差異較大，而與我國臺灣地區的種質遺傳距離最小;聚類分析結果表明，124份甘薯栽培種可劃分為6個類別，其中，新種花、福菜薯18號和黃皮9號3個品種各自單獨組成一個類群，分別為第Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ類;金山57、豫薯8號和瑞薯1號組成第Ⅲ類;第Ⅳ類包含93個地方品種和育成品種;第Ⅵ類由25個地方品種和育成品種組成。其中，菲律賓品種DaJa和Kccane分別與我國地方品種烏骨仔和臺農63聚在一起，遺傳距離較近，分別為0.0333和0.1147，推測與我國甘薯經水路由菲律賓引入我國東南地區這一傳入途徑有關（邵侃和卜鳳賢，2007）。此外，我國地方品種與育成品種間的親緣關系遠、遺傳距離大，而引進品種與我國育成品種間距離較小，說明地方品種資源在我國甘薯育種親本選擇利用方面還具有很大的應用潛力。

4 結論

不同類型和不同來源地的甘薯種質資源間存在較大遺傳差異，以野生種與栽培種間的遺傳差異最大，而栽培種間又以地方品種和引進品種間差異較大，即地方品種資源在我國甘薯育種親本選擇利用方面還具有很大的應用潛力。ISSR分子標記是一種適用于甘薯資源遺傳多樣性分析的理想分子標記。

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（責任編輯 蘭宗寶）