PLA/PCL—PANI復合納米纖維膜的制備及性能研究

王新 駱菁菁 熊杰

摘要：利用靜電紡絲技術，制備了聚苯胺摻雜的聚乳酸/聚己內酯復合導電納米纖維膜，通過掃描電鏡（SEM），探討了不同質量分數配比下的聚苯胺對纖維膜相關性能和纖維表面形貌的影響，并采用紅外光譜分析（FTIR）、X射線衍射（XRD）和熱重分析法（DSC）等測試手段對纖維膜的形貌和結構進行了分析。結果表明，具有一定形貌和電導性的PANI復合納米纖維支架，對細胞在纖維上的吸附和增殖有一定的促進作用，具有良好的生物相容性，作為生物支架材料在組織工程上具有一定的應用前景。

關鍵詞：聚苯胺;聚乳酸;聚己內酯;導電性;表面形貌;組織工程

中圖分類號：TQ342.94

文獻標志碼：A

文章編號：1009-265X（2019）01-0001-05

細胞和材料之間的相互作用是組織工程中的關鍵性問題，支架材料本身的物理化學性質直接影響細胞的行為[1]。數十年來，研究人員通過改變不同物質的物理化學性質，包括材料的化學組成、潤濕能力和表面形態等，來調控細胞和材料之間的相互作用[2]。支架材料的結構和形貌控制著再生組織的結構、尺寸和形貌，作為連接細胞和組織的框架，引導組織生長成特定形態[3]。因此，設計具有適合特定組織類型特征的支架對于實現組織的再生至關重要。原生組織中的細胞被細胞外基質（ECM）包圍，因此模仿ECM的特征有利于組織再生[4]。納米纖維形態被認為是ECM的主要結構特征之一。在眾多制備納米纖維的方法中，靜電紡技術具有大尺度的加工，容易控制纖維直徑或形貌等優點[5]。此外，導電聚合物近年來受到了廣泛關注，研究表明電刺激或物質的電活動會影響細胞行為[6]。導電聚合物如聚吡咯（PPY）和聚苯胺（PANI）可促進神經元的生長和分化，促進神經細胞的吸附和增殖[7]，在體外和體內都具有良好的生物相容性[8]。纖維膜的特性影響著細胞的增殖和分化[9]，本文制備了一種具有特殊形貌和電導性的PLA/PCL—PANI復合納米纖維膜，研究這些性質對細胞行為的影響。

1實驗

1.1材料

聚乳酸（PLA，Mn=150 000），聚己內酯（PCL，Mn=80 000）深圳光華偉業有限公司;六氟異丙醇（HFIP，分析純，鹽城冬陽生物制品有限公司）;聚苯胺（PANI，Mn=65 000），樟腦磺酸（CPSA）美國sigma公司。

1.2溶液的配制

稱取一定量的PLA和PCL（4∶1w/w）溶解在HFIP中，在室溫條件下，使用磁力攪拌器攪拌24 h，獲得質量分數為8%的PLA/PCL混合溶液。稱取相同質量的PANI（Mn=65 000 g/mol）和CPSA將其溶解在HFIP中，水浴超聲處理1 h后，在室溫條件下，使用磁力攪拌器攪拌24 h，使用孔徑為0.45 μm的注射器式的過濾器進行過濾，得到墨綠色溶液。將上述配置的兩種溶液以一定比例混合，最終得到PLA/PCL質量分數為8%混合溶液（其中PANI的含量為1%），以同樣方式分別配置PANI質量分數為2%和3%的混合溶液。

1.3PLA/PCL—PANI復合納米纖維膜的制備

將上述配置的溶液添加到注射器中，在接收距離為13 cm、紡絲電壓為12 kV、溶液流速為0.60 mL/h、相對濕度為30%～40%、室溫的紡絲條件下進行紡絲，得到復合納米纖維膜，將其放在真空干燥箱中干燥24 h。

2PLA/PCL—PANI復合納米纖維膜的表征

通過場發射掃描電子顯微鏡（FE—SEM）（S4800，日本）觀察復合納米纖維的形貌，樣品被鍍金60 s后觀察以增加纖維形貌的清晰度;靜電紡納米纖維膜的直徑通過圖片分析軟件（Image—J software）進行分析。靜電紡納米纖維膜的潤濕性通過水接觸角進行測試，液滴的大小為0.5 μL，同一個樣品在相同間距下對多個點進行測試求取水接觸角的標準偏差;用傅里葉紅外交換光譜儀（ATR—FTIR）檢測纖維膜化學結構的變化，采用溴化鉀壓片，光譜范圍為4 000～400 cm-1。使用差示掃描量熱儀（DSC）（Q20，美國）對復合納米纖維膜的熱力學性能進行分析，升溫速率為10 ℃/min，升溫范圍為20～200 ℃。采用X射線衍射儀（XRD）（D8 discover，美國）對復合納米纖維膜的結晶度進行檢測，掃描范圍為10°～45°，掃描速度為2°/min。用紫外可見光光度計（UV—VIS）對PLA/PCL—PANI納米纖維膜的光學性能進行檢測，根據吸收譜上的某些特征波長處的吸光度的高低來判別或測定該物質的含量，測定的波長范圍為190～1 100 nm。電導性測試則通過循環伏安法進行測試。細胞增殖測試（MTT分析法）是將制備好的纖維膜裁剪成直徑為10 mm的圓，放置在96孔板中。接種小鼠胚胎成骨細胞（NIH—3T3）前，用70%的乙醇浸泡4 h，然后用無菌的PBS反復漂洗3次。使用70%的乙醇溶液對PLA/PCL—PANI復合納米纖維膜進行消毒。具體步驟如下：用含10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔5×103個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL。培養1，4，7 d后，每孔加MTT溶液（5 mg/ml PBS）20 μL。繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

3結果與討論

3.1PLA/PCL和PLA/PCL—PANI復合納米纖維膜的形貌分析

圖1中顯示了在相對濕度為40%，不同PANI含量下制得復合納米纖維膜的電鏡圖片，其中a、b、c、d分別代表PANI質量分數為0，1%，2%，3%的納米纖維，在這里分別用PLA/PCL、PLA/PCL—PANI（1%）、PLA/PCL—PANI（2%）、PLA/PCL—PANI（3%）代替不同PANI含量下的納米纖維。圖1可以觀察到PLA/PCL、PLA/PCL—PANI（2%）納米纖維表面有密集的溝槽出現，可能是因為非溶劑誘導溶液相分離，即空氣中的水蒸氣與射流溶液中的溶劑混合，起到非溶劑的作用，引起溶液發生液—液相分離，形成聚合物富集相和溶劑富集相[10]。而溶劑揮發過程中，射流隨之固化，溶劑富集相形成孔道，聚合物富集相形成纖維骨架，從而形成的纖維具有褶皺的表面，且表面具有縱向的溝槽和凸起的棱，纖維內部為實心結構。

靜電紡納米纖維的直徑受到聚合物溶液的濃度、溶液的電導率、流率和電壓等多種因素影響。圖2觀察到納米纖維的直徑隨著PANI含量的增加而逐漸減小，可能是因為溶液電導率的增加。從直徑頻率分布曲線可以看出，PLA/PCL和PLA/PCL—PANI（2%）下納米纖維直徑分布的比較分散，而PLA/PCL—PANI（1%）和PLA/PCL—PANI（3%）中納米纖維的直徑分布相對比較集中，納米纖維的平均直徑隨著PANI含量的增加而逐漸減小。

3.2FTIR光譜分析

從圖3中可以看出，曲線d在3 436 cm-1對應是—OH，—NH的伸縮振動吸收峰。其中以分子中氫鍵為主，然而通過比較可以發現，曲線b，c，d在此處的吸收峰的峰寬和峰面積隨著聚合物中PANI含量的增加而增加。在3 100～3 000 cm-1對應著芳環上C—H伸縮振動，3 000～2 700 cm-1對應著飽和C—H伸縮振動吸收。曲線c中波數2 335 cm-1，1 759 cm-1，1 462 cm-1，1 350 cm-1分別對應著PANI，PLA和PCL中的CN伸縮振動，CO伸縮振動，C—H面內彎曲振動，C—N伸縮振動吸收。而1 184 cm-1和1 087 cm-1則對應著PLA和PCL中的C—O伸縮振動及對稱振動的特征吸收峰。曲線d所表示的PANI復合納米纖維的紅外光譜上，除了含有曲線a的特征峰外，PANI所具有的特征峰也存在，這說明經摻雜后的復合纖維和PANI是共混體系。此外，除了上述PLA，PCL和PANI的特征峰外，曲線d中沒有其他特征峰的出現，這說明PANI在添加過程中并未與聚合物及溶液發生化學反應，復合纖維的分子鏈未發生變化。

3.3DSC表征

圖4DSC分析譜圖顯示了3個特征峰，分別是共混物中PCL位于58 ℃的熔融峰（Tm）和PLA在96.6 ℃處的結晶峰（Tc），以及PLA位于152 ℃的熔融峰（Tm）。在添加PANI后熔融峰位置幾乎沒有發生改變，熔融峰的峰寬卻隨著PANI含量的增加而增加。兩個熔融峰的存在，以及峰寬的增加都能夠說明PLA和PCL間是不相容的。結晶峰的峰位置發生了明顯的位移，相比較PLA/PCL添加了PANI后PLA更容易結晶。PLA作為一種半結晶聚合物，其峰的位移和結晶度的增大，這是由于PANI和少量的PCL作為異相成核劑使得PLA的分子鏈，能夠依附于殘留在熔體中粗糙的雜質表面有序排列，PANI中氨基基團與熔體分子中的羥基產生的分子間氫鍵，也有助于結晶的生成，使得PLA相能夠快速成核結晶。

3.4XRD圖譜分析

圖5為純的PLA/PCL和不同PANI含量下的PLA/PCL—PANI復合納米纖維膜的XRD圖譜，從圖5中可以看出PLA作為一類結構無序度高的能量介穩態半結晶聚合物，在衍射角為14.20°和24.42°處分別出現了不是很尖銳的峰包和比較明銳的衍射峰，這也說明了PANI誘導后形成的聚乳酸晶體主要是α晶型。加入PANI后復合體系衍射峰位置與純PLA/PCL相比無明顯偏移，且沒有新的衍射峰出現，這說明PANI并不會誘導PLA/PCL出現新的晶型，但少量的PANI卻能起到很好的異相成核作用，誘導PLA形成了大量的晶體。這是由于當PANI的質量分數較小時，少量的PANI可以充當成核劑，起到異相成核的作用，誘導無定形的PLA進行結晶。但當PNAI的含量增大時，有較強運動能力的PANI鏈段自身會先聚集在一起，規整排列形成較大體積的晶核，這時PANI晶核的比表面積相比于質量分數為1%時的有所下降，PLA和PANI的相對接觸面積減小，溶液中只有少量的PLA可以圍繞PANI晶核進行生長，其余大部分的PLA分子鏈依然處于無序狀態。因此可以看出少量的PANI對PLA結晶有促進作用，但隨著PANI含量的增加PLA結晶將受到影響。

3.5UV—VIS分析

在紫外可見光譜圖中（圖6），PLA—PCL紫外吸收曲線并沒有特征的吸收峰，吸收強度沿長波方向沒什么變化，對光呈透過性。PANI復合納米纖維膜在200～1 000 nm波長范圍內則有明顯的吸收峰，在203 nm處的E2帶，中等強度吸收是由苯環的共軛二烯所引起，又稱K帶;K帶是由共軛體系的π→π*躍遷產生的，躍遷所需要的能量較R吸收帶要大，K吸收帶是共軛分子的特征吸收帶，PANI含有苯環和苯醌，分子有共軛CC，CN雙鍵，二者都能夠吸收紫外光或可見光的發色團;B帶也是苯環上3個雙鍵共軛體系中的π電子向π*反鍵軌道躍遷和苯環的振動相重疊引起的，但相對來說，該吸收帶強度較弱。芳香族化合物的特征吸收帶，一般在230～270 nm之間出現精細的結構吸收，又稱苯的多重吸收。之所以在321→451 nm間觀察到紫外的特征吸收帶，首先這是因為作為發色團的CC雙鍵在PANI摻雜后形成的助色基團的作用下，可以使生色基團吸收波長變長，吸收強度增強。助色基團中的n電子可以產生P-π共軛，使π→π*躍遷能量降低，因而使吸收波向長波方向移動，發生所謂的紅移;其次是因為苯醌結構含有CC，CN雙鍵，兩個生色基團相互影響，且隨著共軛體系的增長，其最大吸收峰移向長波方向甚至可達到可見光區域，隨著波長的紅移，吸收強度也增大。因此，E帶和B帶都發生了紅移，出現了譜圖中觀察到的現象。

3.6納米纖維膜潤濕性能分析

從PANI復合納米纖維膜的水接觸角變化趨勢圖7可以看出，納米纖維膜的水接觸角隨著PANI含量的增加而減小，潤濕性能逐漸增強;而在PANI3時水接觸角減少的趨勢減緩，這是由于對于一定的固體表面，在液相中加入表面活性物質?？筛纳茲櫇裥阅?，并且隨著液體和固體表面接觸時間的延長，接觸角有逐漸變小趨于定值的趨勢。PANI容易團聚從而使納米纖維膜的粗糙程度增加，潤濕性能減弱。

3.7納米纖維膜的電導性分析

本征態聚苯胺是藍色的，處于中間氧化態，它本身不導電;然而經過樟腦磺酸摻雜之后，得到了一種呈墨綠色的聚苯胺，是處于中間氧化態和全還原態之間的一種特殊的狀態，這種摻雜態即是我們所熟知的具有一定導電性的聚苯胺。聚苯胺有較高的電導率，但聚苯胺在普通溶劑中溶解性很差，可選擇的溶劑也很少，且隨著聚苯胺在混合溶液中含量的增加，溶液的可紡性也變得很差。圖8中可以看出隨著PANI含量的增加，電導率逐漸增加。

a.PLA/PCLb.PLA/PCL—PANI（1%）c.PLA/PCL—PANI（2%）d.PLA/PCL—PANI（3%）圖8納米纖維膜的電導率測試

3.8細胞增殖分析（MTT分析）

通過MTT法檢測PLA/PCL—PANI復合納米纖維膜的生物性能，檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490 nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值（OD值），來間接反映活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強。從圖9中可以看出，不同含量的PANI復合納米纖維組與PLA/PCL組及細胞培養板組相比，細胞在PANI復合納米纖維膜未顯示出細胞毒性，隨著培養時間的增加，細胞在不同含量的PANI復合納米纖維膜上能夠很好的增殖，且細胞數量隨著培養時間的增加而逐漸增加。與其他組份相比較，在復合納米纖維膜PANI2上細胞增殖的數量的尤其明顯。

4結論

a）通過DSC和XRD熱力學測試結果表明PANI并不會誘導PLA/PCL出現新的晶型，但少量的PANI卻能起到很好的異相成核作用。

b）通過FTIR和UV—vis測試進一步表征經樟腦磺酸摻雜后PANI官能團的變化，發現PLA—PCL納米纖維膜的紫外吸收曲線并沒有特征的吸收峰，吸收強度沿長波方向沒什么變化，對吸收光呈透過性。隨著PANI含量的增加，其最大吸收峰移向長波方向甚至可達到可見光區域，隨著波長的紅移，吸收強度也逐漸增大。

c）通過MTT、SEM、水接觸角測試說明具有一定形貌和電導性的PANI復合納米纖維膜能夠很好地促進細胞的吸附和增殖，在細胞支架應用領域具有一定的前景。

參考文獻：

[1] LINS L C，WIANNY F，LIVI S，et al. Development of bioresorbable hydrophilic—hydrophobic，electrospun scaffolds for neural tissue engineering[J]. Biomacromolecules，2016，17（10）：3172-3187.

[2] VALENTE T A M，SILVA D M，GOMES P S，et al. Effect of sterilization methods on electrospun poly（lactic acid） （PLA） fiber alignment for biomedical applications[J]. Acs Applied Materials & Interfaces，2016，8（5）：3241-3249.

[3] SHOKRY H，VANAMO U，WILTSCHKA O，et al. Mesoporous silica particle—PLA—PANI hybrid scaffolds for cell—directed intracellular drug delivery and tissue vascularization[J]. Nanoscale，2015，7（34）：14434-14443.

[4] MORILLE M，TOUPET K，MONTRRO—MENEI C N，et al. PLGA—based microcarriers induce mesenchymal stem cell chondrogenesis and stimulate cartilage repair in osteoarthritis[J]. Biomaterials，2016（88）：60-69.

[5] ZHAO Y，AROWO M，WU W，et al. Effect of additives on the properties of polyaniline nanofibers prepared by high gravity chemical oxidative polymerization.[J]. Langmuir the Acs Journal of Surfaces & Colloids，2015，31（18）：5155-5163.

[6] PRABHAKARAN M P，GHASEMIMOBARRAKEH L，JIN G，et al. Electrospun conducting polymer nanofibers and electrical stimulation of nerve stem cells.[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering，2011，112（5）：501-507.

[7] ZHOU Z F，ZHANG F，WANG J G，et al. Electrospinning of PELA/PPY fibrous conduits： promoting peripheral nerve regeneration in rats by self—originated electrical stimulation[J]. Acs Biomaterials Science & Engineering，2016，2（9）：1572-1581.

[8] RUSSO V，TAMMARO L，DI MARCNTONIO L，et al. Amniotic epithelial stem cell biocompatibility for electrospun poly（lactide—co—glycolide），poly（ε—caprolactone），poly（lactic acid） scaffolds[J]. Materials Science & Engineering：c，Materials for Biological Applications，2016（69）：321-329.

[9] LI Y，LI X，ZHAO R，et al. Enhanced adhesion and proliferation of human umbilical vein endothelial cells on conductive PANI—PCL fiber scaffold by electrical stimulation[J]. Materials Science & Engineering C，2016（72）：106-112.

[10] 曾一，丁懷宇，施艷蕎，等.熱致相分離法微孔膜（Ⅰ）相分離和孔結構[J].膜科學與技術，2006，26（5）：93-98.