EDTA對豬肉12-脂肪氧合酶構象及酶活力的影響

王晶晶 張新笑 卞歡 耿志明 李鵬鵬 王道營 徐為民

摘要：【目的】探究乙二胺四乙酸鈉（EDTA）對豬肉12-脂肪氧合酶（12-LOX）構象和酶活力的影響，為豬肉加工貯藏過程中控制12-LOX活性提供參考依據?！痉椒ā坎捎肊DTA處理豬肉12-LOX，測定其酶活力，并分析EDTA對豬肉12-LOX的儲藏穩定性、熱穩定性、催化亞油酸反應、熒光光譜和圓二色譜（Circular dichrosim spectra，CD）的影響?！窘Y果】添加EDTA可抑制豬肉12-LOX的酶活力，隨EDTA濃度的增加，抑制作用逐漸增強，當EDTA濃度為10.0 mmol/L時，豬肉12-LOX活力約下降60%。EDTA能提高豬肉12-LOX的熱穩定性和貯藏穩定性，使其比正常條件下保持較高酶活力。隨著EDTA濃度的增加，豬肉12-LOX分子內部的α-螺旋和β-折疊含量降低，引起其二級結構發生明顯變化;豬肉12-LOX的熒光強度不斷減弱，EDTA濃度為20.0 mmol/L時，酶的內源熒光發射峰強度下降13%，但最大發射峰（λmax）的位置未發生變化?！窘Y論】EDTA能引起豬肉12-LOX的構象變化進而抑制其酶活力。

關鍵詞： 豬肉;12-脂肪氧合酶（12-LOX）;乙二胺四乙酸鈉（EDTA）;活力;構象

中圖分類號： S879.2;TS251? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）09-2052-06

Abstract：【Objective】To investigate the effects of sodium ethylene diamite tetracetate（EDTA） on the conformation and enzyme activity of porcine 12-lipoxygenase（12-LOX）， and provide reference for controlling 12-LOX activity during pork processing and storage. 【Method】Porcine 12-LOX was treated with EDTA to determine the enzyme activity of porcine 12-LOX， and the storage stability， thermal stability， catalytic linoleic acid reaction， fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectra（CD） of EDTA effects on porcine 12-LOX were analyzed. 【Result】The results showed that EDTA inhibited the activity of porcine 12-LOX and the inhibitory effect increased with the increasing of EDTA concentration. When the concentration of EDTA was 10.0 mmol/L， the activity of porcine 12-LOX decreased by 60% approximately. The addition of EDTA could increase the thermal stability and storage? stability of porcine 12-LOX and make porcine 12-LOX retain enzyme activity for a longer time than normal conditions. As the concentration of EDTA increased， the content of α-helix and β-sheet inside the porcine 12-LOX molecule decreased， causing obvious change in its secon-dary structure and the fluorescence intensity of porcine 12-LOX was continuously weakened. When the concentration of EDTA was 20.0 mmol/L， the intensity of the endogenous fluorescence emission peak of the enzyme decreased by 13%， but the position of the maximum emission peak（λmax） did not change. 【Conclusion】Collectively， this study indicates that EDTA can cause conformational change of porcine 12-LOX and result in the activity change of porcine 12-LOX， which may providereference for the control of LOX activity during meat processing and storage.

Key words： porcine; 12-lipoxygenase（12-LOX）; sodium ethylene diamite tetracetate（EDTA）; activity; conformation

0 引言

【研究意義】肉制品在加工過程中易發生脂質氧化，影響肉制品風味。脂類物質的氧化分為自動氧化和酶促氧化（張迎陽，2014），脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX）是酶促氧化最主要的內源酶，其專一性作用于多不飽和脂肪酸（PUFA）的順，順-1，4-戊二烯基位置，通過分子內加氧，生成具有共軛雙鍵的氫過氧化物。氫過氧化物極不穩定，進一步反應生成多種揮發性化合物，這些物質一方面形成食品的主要風味物質（郇延軍，2005;Roldan et al.，2014）;另一方面，食品中脂質的過度氧化產生刺激性氣味物質，不僅引起食品風味劣變，還造成PUFA含量下降，導致食品營養品質降低，增加儲藏難度（曹錦軒等，2015;Mashima and Okuyama，2015;Stephany et al.，2015;吳寶森等，2017;Navicha et al.，2017）。因此，研究乙二胺四乙酸鈉（EDTA）對豬肉中LOX活性的影響，以期在實際應用中控制酶活力，從而使肉制品呈現良好風味?！厩叭搜芯窟M展】Gata等（1996）從豬的股二頭肌中分離得到一種LOX，研究發現其可能參與伊比利亞火腿的風味形成。Fu等（2009，2015）研究發現，白鰱魚體內的LOX能快速催化降解不飽和脂肪酸，產生與腥味相關的各種醛類物質，從而導致白鰱魚在貯藏和加工過程中出現腥味增強問題。Jin等（2011）的研究結果表明，LOX在干腌培根加工過程中的脂肪氧化起重要作用，酸度、溫度和鹽含量是影響LOX活性的主要因素。因此，LOX的催化活性和影響因素成為肉品加工的研究熱點。LOX屬于氧化還原酶（閆靜芳等，2013），廣泛存在于動植物界中，是一種含非血紅素鐵的雙加氧酶，其金屬輔基的活化態為氧化性三價鐵離子，非活化態為二價鐵離子。豬肉12-LOX分子量約62 kDa，其X-射線衍射結果顯示豬肉12-LOX包括2個結構域，即氨基端的PLAT結構域和羧基端的催化結構域（汪曉鳴，2014;張爽，2014）。外源物質引入會導致LOX的構象變化從而影響其催化行為。Cai等（2004）研究表明，外源鐵離子以電子傳遞方式與大豆LOX活性中心鐵發生作用，促進酶促反應進程。蔡燕（2011）、蔡燕等（2015）的研究結果表明，外源銅離子和鋇離子均能與大豆LOX活性中心鐵離子發生交換作用，從而抑制催化氧化豆油的反應。因此，在肉品加工和貯藏過程中控制和添加某些無機鹽、有機電解質等物質可調控肉制品LOX活性，從而控制肉品風味?！颈狙芯壳腥朦c】EDTA是一種金屬離子螯合劑，能與12-LOX活性中心的鐵離子結合，從而影響12-LOX活力。但目前未見有關EDTA對豬肉LOX活性影響的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】將EDTA加入到豬肉12-LOX的催化反應體系中，觀察外源EDTA對豬肉12-LOX的催化活性、圓二色譜（Circular dichrosim spectra，CD）和熒光光譜的影響，研究EDTA與豬豬肉12-LOX的相互作用，為豬肉加工貯藏過程中控制12-LOX活性提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

豬肉12-LOX為前期課題組制備，亞油酸購自Sigma公司，鹽酸、檸檬酸、檸檬酸三鈉、EDTA、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等均為國產分析純，購自生物工程（南京）股份有限公司。主要設備儀器：BioTek-Synergy2多功能酶標儀（美國BioTek公司）、M124A分析天平（意大利BEL公司）、HH-1數顯恒溫水浴鍋（普析通用，常州國華電器有限公司）、MOS-450圓二色譜儀（法國Biologic公司）、LS-55 Fluorescence Spectrometer（美國PerkinElmer公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 酶活力測定

1. 2. 1. 1 底物溶液配制 將0.5 mmoL亞油酸溶于5 mL脫氧重蒸水（含180 μL Tween-20）中，使其充分混勻;逐滴加入1 mol/L氫氧化鈉充分混勻直至體系清澈透明，再用1 mol/L鹽酸調pH至9.0，直至亞油酸完全溶解，最后用脫氧重蒸水定容至50 mL。準備數支4 mL EP管，將該亞油酸儲備液分裝保存在EP管中，于-20 ℃下儲存備用（何立超等，2016）。

1. 2. 1. 2 豬肉12-LOX活力測定 豬肉12-LOX活力測定方法在Kermasha和Metche（1986）的基礎上有所改進。將20 μL亞油酸底物儲備液與160 μL 50 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 5.5）充分混勻，再加入20 μL酶液迅速混勻，于234 nm處測定其1 min內吸光值的增加量。以不加酶液（20 μL亞油酸底物與180 μL檸檬酸緩沖液）為空白。LOX活力定義（Szymanowska et al.，2009）：在一定溫度和pH條件下，反應體系在234 nm波長處吸光值每分鐘增加0.001表示為1個酶活力單位（U）。

1. 2. 2 EDTA對豬肉12-LOX活力的影響 按照酶活力測定方法，在反應總體系中加入EDTA溶液，使其終濃度分別為0（空白對照）、0.5、1.0、5.0、10.0和20.0 mmol/L，測定其酶活力，以酶活力最高值為100%，即縱坐標為相對酶活力。

1. 2. 3 EDTA對豬肉12-LOX儲藏穩定性的影響 豬肉12-LOX酶液在4 ℃下儲藏7 d，分別測定0～7 d的酶活力;另外，在豬肉12-LOX酶液中加入EDTA，相同條件下測定酶活力，以酶活力最高值為100%。

1. 2. 4 EDTA對豬肉12-LOX熱穩定性的影響 取100 μL豬肉12-LOX酶液在50 ℃水浴中分別水浴0、1、2、3、4、6和8 min，取出后置于冰上，測酶活力，以0 min的酶活力為100%;在酶液中加入EDTA后，按照上述方法測定酶活力。

1. 2. 5 EDTA對豬肉12-LOX催化亞油酸反應的影響 在酶活反應體系中，加入20 μL EDTA，測定30 min內酶活力的變化。以未加入EDTA的酶活力反應體系為對照。

1. 2. 6 EDTA對豬肉12-LOX CD光譜的影響 CD光譜能有效分析蛋白質二級結構的變化，常用于蛋白質二級結構測定（Kouassi et al.，2007）。以50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.6）為空白對照，CD光譜的掃描波長范圍為200～250 nm，光源為氙燈，液池光徑1 mm，在范圍內掃描累加3次。掃描速度50 nm/min，豬肉12-LOX酶液濃度0.1 mg/mL。用平均橢圓率[θ]表示CD數據，單位為deg·cm2/dmol（Parker and Rees，1960）。

1. 2. 7 EDTA對豬肉12-LOX熒光光譜的影響 蛋白質分子中的芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸基團具有內源熒光性，在一定波長照射下會產生熒光，且熒光的產生會隨著外界條件的改變而變化，因此蛋白質三級結構的變化可通過熒光光譜分析（Zhong et al.，2009）。具體方法：在1 mL EP管中加入不同濃度EDTA ，然后加入50 μL豬肉12-LOX酶液（稀釋至0.1 mg/mL），混勻后測定其在290～450 nm的熒光光譜，所有試驗重復3次，以50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.6）為空白對照。激發波長280 nm，激發及發射光柵狹縫寬5 nm，激發狹縫寬度設為3 nm，速率240 nm/min。

2 結果與分析

2. 1 EDTA對豬肉12-LOX活力的影響

由圖1可知，隨著EDTA的加入，豬肉12-LOX活力逐漸降低。EDTA濃度較低時，對豬肉12-LOX活力影響不明顯，其酶活力基本沒有變化，隨著EDTA濃度的增加，豬肉12-LOX活力快速下降。當EDTA濃度為5.0 mmol/L時，豬肉12-LOX活力降至原來的80%;當EDTA濃度為10.0 mmol/L時，豬肉12-LOX活力已下降至40%左右;而EDTA濃度為20.0 mmol/L時，LOX完全失去活性。LOX是一種含非血紅素鐵的蛋白質，EDTA作為一種金屬離子螯合劑能與鐵離子結合，從而使豬肉12-LOX活力降低甚至消失。

2. 2 EDTA對豬肉12-LOX儲藏穩定性的影響

液態酶在常溫條件下容易失活，即使在4 ℃下，酶活也不易保持。如圖2所示，豬肉12-LOX在4 ℃下酶活力不穩定，儲藏5 d后酶活力喪失30%左右，7 d后酶活力喪失55%左右。在加入EDTA后，豬肉12-LOX活力較穩定，儲藏5 d后酶活力喪失20%左右，7 d后酶活力喪失40%左右?？梢?，EDTA對豬肉12-LOX的穩定性有一定促進作用。

2. 3 EDTA對豬肉12-LOX熱穩定性的影響

LOX是一種熱不穩定性酶，在受熱條件下易失活。由圖3可知，在50 ℃受熱條件下，豬肉12-LOX的酶活力一直下降，水浴8 min時酶活力已降至原來的20%左右;在加入EDTA后，水浴8 min時酶活力下降至原來的30%左右，豬肉12-LOX對熱變性的抵抗能力有所提高，失活率有所下降，酶活殘余量略有增加。

2. 4 EDTA對豬肉12-LOX催化亞油酸反應的影響

如圖4所示，在0～15 min內，兩種反應體系中豬肉12-LOX活力均呈逐漸升高趨勢，其中加入EDTA的反應體系中酶活力有所降低。在隨后的反應中，加入EDTA的反應體系中豬肉12-LOX活力不再升高，達到反應平衡，而未加EDTA的反應體系中其酶活力略有升高后達反應平衡，進一步證實EDTA能抑制LOX活力。

2. 5 EDTA對豬肉12-LOX CD光譜的影響

蛋白質二級結構中主要的光活性基團是肽鍵，其吸收峰分布在蛋白質CD的遠紫外區段（190～240 nm），一般α-螺旋特征吸收峰在208和222 nm左右，β-折疊在215 nm左右有一特征吸收負峰（Greenfield，1996，2006;Li et al.，2013）。如圖5所示，天然狀態的LOX遠紫外CD在208和222 nm處顯示負雙峰曲線，在215 nm處顯示1個負肩峰。加入EDTA后，豬肉12-LOX在208、222和215 nm處的特征吸收峰強度下降，表明豬肉12-LOX的ɑ-螺旋和β-折疊含量降低，EDTA的加入使其二級結構發生變化，且隨EDTA濃度的增加，二級結構的變化越明顯。

2. 6 EDTA對豬肉12-LOX熒光光譜的影響

EDTA的加入會影響蛋白質所處的微環境，改變氨基酸中內源性熒光生色基團的位置和微環境，從而使其熒光光譜發生變化，因此可通過內源性熒光光譜來檢測EDTA對蛋白質構象的影響。通過研究EDTA處理對豬肉12-LOX蛋白熒光性質的影響，可得出其構象變化信息。EDTA與豬肉12-LOX相互作用后其熒光發射光譜的變化如圖6所示，隨著EDTA濃度的增加，豬肉12-LOX的熒光強度逐漸降低，在EDTA濃度為20 mmol/L時，酶的內源熒光發射峰強度下降了13%，但最大發射峰（λmax）的位置未發生變化。有研究表明，λmax與色氨酸（Trp）殘基所處微環境緊密相關，Trp殘基位于蛋白質分子內部的非極性環境或外部的極性環境時，對應λmax小于330 nm或大于330 nm（Lefevre et al.，2007）。本研究中λmax在340 nm附近，說明其Trp殘基主要分布在蛋白質分子外部的極性環境中。EDTA的加入使豬肉12-LOX在340 nm處的熒光強度降低，說明二者發生相互作用，導致豬肉12-LOX的內源熒光淬滅，但Trp殘基仍處在極性環境中。

3 討論

EDTA是一種金屬離子螯合物，蔡燕（2011）研究了外源銅離子與鐵離子加入對LOX酶活體系的影響，沈潔等（2017）研究了EDTA對大豆LOX活性和催化體系的影響，而本研究探討EDTA加入對豬肉12-LOX酶活體系的影響。結果顯示，在豬肉12-LOX酶活體系中加入EDTA后，其酶活力逐漸下降，當EDTA濃度為10.0 mmol/L時，豬肉12-LOX活力約下降60%，是因為EDTA與酶活性中心的鐵離子結合，使酶變為非活性態，從而酶活力下降。EDTA對豬肉12-LOX的穩定性有一定促進作用，加入EDTA 5 d后酶活力喪失約20%，7 d后酶活力喪失40%左右，均比未加EDTA組的酶活性提高10%左右;EDTA也能提高豬肉12-LOX的熱穩定性，在50 ℃受熱條件下，水浴8 min時其活力已下降至原來的20%左右，在加入EDTA后，水浴8 min時酶活力下降至原來的30%左右，酶活力提高10%，與沈潔等（2017）的研究結果一致。這可能是因為EDTA作為一種金屬離子螯合劑，能夠與LOX活性中心的鐵離子結合，從而使酶活降低，使其儲藏穩定性和熱穩定性有所提高。CD光譜結果表明，EDTA的加入能降低豬肉12-LOX內部的α-螺旋和β-折疊含量，引起其二級結構發生變化。熒光強度隨著EDTA的加入逐漸降低，在EDTA濃度為20.0 mmol/L時，酶的內源熒光發射峰強度下降13%，說明EDTA與豬肉12-LOX相互作用引起LOX的內源熒光淬滅。這與沈潔等（2017）的研究結果存在差異，可能是由于酶源及實驗條件的不同所致。

本研究僅添加單一的EDTA，分析其對豬肉12-LOX活性的影響，下一步將研究其他外源物質的加入及EDTA組合對豬肉12-LOX活性的影響，從而更好地控制肉品加工過程中的LOX活性。

4 結論

EDTA能抑制豬肉12-LOX活性，降低LOX熒光強度及內部α-螺旋和β-折疊含量，引起其二級結構發生變化。此研究可為肉制品貯藏和加工過程中LOX的調控提供參考。

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（責任編輯 羅 麗）