擬南芥的遺傳轉化

劉曉麗 魏楠

摘要：通過構建重組表達載體，轉化農桿菌制作浸染液，實現農桿菌介導法進行目的基因的擬南芥遺傳轉化，將目的基因轉入到野生型擬南芥中。通過篩選和鑒定后，得到陽性的轉基因植株，最終得到純合T3代轉基因株系。后續可以通過對純合轉基因株系和野生型擬南芥進行比較鑒定，即可推斷目的基因在擬南芥中的功能。

關鍵詞：擬南芥;遺傳轉化;實驗

一、實驗材料

（一）試驗材料

轉基因所需的菌株：農桿菌EHA105;轉基因所需的模式植物：野生型擬南芥;轉基因所需的植物表達載體：pCAMBIA3301。

（二）試驗試劑

本實驗所需試劑主要有：Mu-rashige Skoog（MS）培養基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）;YEB、YEP液體培養基;YEP固體培養基;抗生素氯霉素（chlorampheni-col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）;草銨膦（phosphinothricin，PPT）;v/v（1：5）的次氯酸鈉溶液;瓊脂;蔗糖;表面活性劑silwetL-77等。

二、實驗方法

（一）超表達載體的構建

采用質粒小提試劑盒提取擴增、測序結果均正確無誤的pGM-T-目的基因的質粒，具體步驟如下：第一，取2ml過夜培養的含目的基因的大腸桿菌Trans 5a轉化菌液，12，000rpm離心I min，吸除上清;第二，向留有菌體沉淀的離心管中加入150ul溶液P1（已加入RNase A和0.5%的TIANRed），使用渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀;第三，向離心管中加入150ul溶液P2，溫和地上下翻轉6～8次，使菌體充分裂解;第四，向離心管中加入350ul溶液P5，立即快速地上下顛倒12-20次，充分混勻，將出現絮狀沉淀，然后，12，000rpm離心2min;第五，將上一步收集的上清液用移液器轉移到吸附柱CP3中，注意盡量不要吸出沉淀。12，000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液;第六，向吸附柱CP3中加入3001xl漂洗液PWT，12，000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液;第七，重復步驟六;第八，將吸附柱CP3放入收集管中，12，000rpm離心1rain，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除;第九，將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50ul洗脫緩沖液TB，12，000rpm離心30s將質粒溶液收集到離心管中。進行質粒提取后，用兩個內切酶BglII和Pmll分別對pGM-T一目的基因的質粒和pCAMBIA3301載體進行雙酶切。加樣結束后，混勻，37℃酶切10h。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，且對目標片段及pCAMBIA3301骨架進行膠回收。然后，通過連接酶對目標片段和pCAMBIA3301骨架進行連接，構建重組表達載體。轉化大腸桿菌Trans 5a感受態，挑斑、搖菌，進行菌液PCR檢測。挑取陽性pCAMBIA3301一目的基因克隆提取質粒，進行雙酶切驗證和測序。測序正確后，陽性pCAM-BIA3301-目的基因克隆質粒轉化農桿菌EHAl05感受態。

（二）轉化野生型擬南芥

1、野生型擬南芥的種植。野生型擬南芥的種植發苗有直播法和組培法。本實驗中采用組培法。將野生型擬南芥種子播種于MS固體培養基（不含抗生素）上，待長出四葉一心后移栽至花盆中，具體方法如下：第一，MS培養基準備：M519粉末、蔗糖溶于去離子水中，終濃度分別為4.43g/L、30g/L，pH調節至5.8左右，后加入瓊脂（終濃度為7g/L），于121°C，高壓滅菌25min。待MS固體培養基冷卻到不燙手的程度后，無菌條件下，將其分裝到培養皿內，凝固待用。第二，種子消毒：（1）擬南芥種子（200～300粒）置于1.5mL的離心管內;（2）加入I mL75%乙醇溶液消毒I min;（3）吸出乙醇溶液，加入I mL的次氯酸鈉溶液（Naclo：ddH2O=l：5），振蕩洗滌8～10min，短暫離心;（4）在無菌條件下倒掉消毒液，后用無菌去離子水沖洗5-6次。第三，播種：移液槍吸取已消毒的種子于無菌濾紙條上，使用無菌牙簽點播至MS固體培養基上。株距1cm，行距1cm，播種完畢后，封口膜密封，4℃黑暗放置72h。第四，培養：平板至于培養室內，光周期為23℃光照16h，20℃黑暗8h培養7-10d。待植株長至四葉一心時，移栽至營養土里。第五，移栽：營養土使用前需121°C，滅菌30min。冷卻后，營養土、蛭石按l：1的比例混勻，除去雜質后裝進小花盆放置于托盤內，向托盤內噴灑去離子水至表土濕潤為止。

2、浸染。浸染液的準備，方法如下：（1）取檢測結果為陽性的保存于-80°C的農桿菌菌液500uL于20mL含Chl（50mg/L）和Kan（50mg/L）的YEP液體培養基中活化培養;（2）28°C，220rpm，培養至培養基渾濁為止;（3）取以上菌液1mL于200mL含Chl和Kan的YEB液體培養基中進行繼代培養;（4）28℃，220rpm，培養至菌液OD600值為1.0-1.2，不得超過1.2;（5）上述菌液置于4℃，5000rpm條件下離心10min，收集菌體;（6）使用轉化緩沖液重懸菌體，至使OD600為0.8左右，若OD值過高會影響擬南芥后期長勢，若OD值過低則會影響轉化效率;（7）菌液重懸后加入表面活性劑silwet L-77（每10mL菌液加入2uL silwet L-77），混勻靜置一段時間。采用浸染花序法浸染野生型擬南芥植株，方法如下：（1）當野生型擬南芥植株抽薹3-8cm，即可進行浸染;（2）選擇其中生長健壯、長勢相似的野生型擬南芥植株進行浸染;（3）浸染前要對植株進行初步的處理：剪去花葶上已經開放的花朵和已經形成的莢果，僅保留剛露白的花骨朵和花蕾;（4）提前向放置浸染植株的盒子內鋪上一層濾紙，用噴壺打濕待用;（5）將剛露白的花骨朵和花蕾浸在浸染液中，定時5min;（6）植株上所有的花骨朵和花蕾浸染完全后，將植株傾斜放置于預先準備的盒子內，將盒子放置于20-25℃的環境中，暗培養;（7）22～24h后取出暗培養的植株，轉至正常培養條件下繼續培養;（8）為保證轉化效率，擬南芥培養一周左右，進行第二次浸染?；跀M南芥的長勢，在其整個生長周期內根據需要可浸染2～3次;（9）轉化后兩周左右，擬南芥結出大量莢果，使莢果自然成熟、干燥后，收取擬南芥種子即To代轉基因種子;To代種子置于干燥的環境下2周以上即可用于后期的篩選。

3、純合陽性轉基因擬南芥株系的篩選。直播法是將To代種子均勻撒入花盆營養土中，表面覆蓋一層薄土;保持營養土的濕潤;當To代種子發芽長至3～4片真葉時噴灑50mg/L的PPT溶液;每天觀察幼苗生長情況，3-4h后根據實際情況繼續噴灑100mg/L或200mg/L的PPT溶液;最終存活的幼苗即為疑似陽性植株，取葉片進行分子鑒定。收獲T1代種子進行后續實驗。

4、陽性轉基因株系的鑒定。鑒定為陽性的轉基因To代植株，分株收獲得到T1代轉基因種子。組培法種植T1代轉基因種子，由孟德爾遺傳定律知T1種子的分離比，抗性植株：不抗植株=3：1，選擇抗性植株中葉片和根系均生長正常的幼苗移栽，分株收獲得到T2代種子;組培法種植T2代轉基因種子，其中，幾乎全部發芽的株系則為純合株系，留下此株系的T3代種子。

三、結果與分析

（一）目的基因轉化擬南芥

采用組織培養法進行野生型擬南芥的種植。待植株長至四葉一心之后，挑選長勢一致的幼苗進行移栽。待野生型植株抽薹3-8cm且剛剛開始開花時即可進行浸染。待到莢果自然成熟、干燥后便收取得到To代種子。

（二）目的基因的陽性轉基因苗的篩選

1、To代的篩選。由于pCAM-BIA3301載體上含有Kan和PPT抗性位點，所以，采用了直播法和組培法進行To代種子的種植。直播法是使用適當濃度的PPT噴灑植株幼苗進行篩選。組培法是將To代種子種植于含有Kan的MS固體培養基上進行篩選。陽性的轉基因植株可以在噴灑PPT后正常生長，也可在含有Kan的MS固體培養基上正常生長。組培法中，由于抗生素Kan影響葉綠體、線粒體蛋白的合成，固不含有抗性基因的植株在MS培養基上萌發后黃化而死亡。直播法得到的疑似陽性植株和組培法中培養基上疑似陽性植株生長到一定階段后將其移栽至新的營養土中繼續培養。得到的疑似陽性轉基因T。代植株，分株收獲，得到T1代種子。

2、To代的篩選。將T。代種子點播至含有Kan的MS固體培養基上，由孟德爾遺傳定律知T1代種子將按照3：1的比例發生分離，即有三分之一的T1代種子不能發芽。植株生長到一定階段后選擇移栽那些葉片嫩綠，根系發達的T1代幼苗。待莢果成熟后，分株收獲，得T2代種子。

3、T2代的篩選。T2代種子的篩選同上，由孟德爾遺傳定律知T2代種子一些株系按照3：1的分離比分離，而一些株系不發生分離即為純合株系。將篩選出的純和株系繼續培養，得到T3代種子進行下一步的表型鑒定。

四、討論

在擬南芥的生長周期內，溫度要保持在20～25℃。在苗期時室內的濕度可適當高些，在生長周期內不超過50%。在擬南芥結莢時一般空氣濕度應保持在30%左右。浸染期間，溫度保持在20～25°C，避免溫度太高。暗處理時間也不宜過長，一般22～24h即可，以免植株長時間避光而黃化，影響植株長勢，從而降低浸染效率。

超量表達載體pCAMIBA3301所用啟動子為35S啟動子，可使目的基因超強表達，一般情況下，陽性轉基因植株中的目的基因表達量會遠遠高于對照組植株，但由于轉化、生長及外源基因整合位置的不確定性等多種因素，不同轉基因植株目的基因的表達量會存在一定程度上的差異。因此，在研究過程中，為避免各株系之間的差異對功能研究的影響，選取目的基因表達量相近，且表達量較高的轉基因陽性植株進行研究?；谥仓曜陨淼呐磐鈾C制及遺傳分離規律，將To及T1代定為不穩定世代，以T2或T3代作為純合世代進行生理生化及分子功能研究，結果可信度更高，且表型或生理生化特征更加穩定。值得說明的是，單獨使用抗生素（Kan）對轉基因To代植株進行篩選時，會出現假陽性現象，從而加大后期T1代株系篩選的工作量，延緩了實驗進程。因此，適時對To代轉基因植株進行分子水平的鑒定，杜絕假陽性轉基因植株的出現是非常有必要的。