土木香總內酯致大鼠胃黏膜損傷作用及其對前胃黏膜凋亡的影響

胡又 謝穎 陳雪 王瑩

摘要：目的：明確土木香總內酯灌胃對SD大鼠胃黏膜的損傷作用及其對大鼠前胃黏膜凋亡的影響。方法：選取40只SD大鼠隨機分為2組，對照組用溶媒CMC-Na、給藥組用土木香總內酯（120mg/kg）連續灌胃28天，用HE染色觀察大鼠胃黏膜的病理改變，用TUNEL方法檢測大鼠前胃黏膜的凋亡情況。結果：與對照組相比，給藥組大鼠前胃黏膜過角化、鱗狀上皮單純增生與乳頭狀增生的發生率顯著增加。在給藥后發生的增生性病變中，凋亡指數隨增生嚴重程度的增加而降低。結論：土木香總內酯能誘發大鼠前胃黏膜發生過角化與增生性病變，其機制可能是土木香總內酯通過抑制前胃鱗狀上皮的凋亡導致增生的發生。

關鍵詞：土木香總內酯;胃黏膜損傷

中圖分類號：$859.7 文獻標識碼：A 文章編號：2096-5249（2019）04-119-003

土木香總內酯是中藥土木香的有效成分，具有抗菌、驅蟲、保肝等藥理作用，現代有大量研究表明其通過細胞毒性作用與促凋亡活性發揮抗腫瘤療效。盡管土木香總內酯藥理作用強大，但目前土木香總內酯是否具有毒性作用，有哪些毒性病理學變化，產生毒性作用的機制如何，停藥后毒性損傷是否能夠恢復，以上問題均未見文獻報道。本研究對SD大鼠進行了土木香總內酯灌胃28天毒理學試驗，以明確土木香總內酯是否具有毒性作用，并探討其毒性作用機制，為土木香的安全應用提供毒理學資料。

1材料與方法

1.1動物 6周齡的SPF（specific pathogen free，SPF）級SD大鼠，雌雄各半，共40只（遼寧新藥安全評價中心提供）。動物飼養于遼寧新藥安全評價中心屏障系統內（室溫23±2℃，相對濕度40-60%，12小時明暗循環），采用標準飲食，滅菌自來水，自由攝食攝水。本研究中的動物使用情況符合國家動物福利法律法規（2006年，中華人民共和國科學部），動物福利得到IACUC（theInstitutionalAnimal CareandUse Committee）的批準。

1.2樣品土木香總內酯，由遼寧新藥安全評價中心提供;本品為白色至淡黃色結晶固體，含量為97.0%。臨用前稱量，用CMC-Na配制，現用現配。

1.3分組與給藥 經環境適應性飼養1周后，將所有動物隨機分為2組：對照組使用溶媒CMC-Na、給藥組使用120mg/kg土木香總內酯進行灌胃，每組20只動物，雌雄各半。連續灌胃給藥28天。

1.4樣本采集在實驗第29天處死大鼠。在麻醉后進行解剖，打開腹腔，取出全胃，沿大彎剖開，暴露胃黏膜，肉眼觀察胃黏膜改變，記錄病灶部位、數目、大小、形態。并將胃組織固定在10%的中性福爾馬林中。

1.5病理組織學觀察 將固定后的胃組織沿目的縱軸連續切成3～5mm寬的組織條塊，并做成3pm的連續石蠟切片。通過HE染色（Hematoxylin and Eosin，HE）觀察胃黏膜的病理變化。診斷標準參照INHAND標準。結果由一位病理專家進行病變診斷及病變程度的鑒定，后由另一位病理專家采取盲法閱片。

1.6±UNEL法檢測凋亡 采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（產品編號：WLA029b，wanleibio Inc，Liaoning，China）?？酒撓炈?，用PBS清洗5分鐘，檸檬酸抗原修復液（MVS-0066，Maixin Inc。，Fuiian，China）中火修復5分鐘，滴加過氧化氫室溫孵育10分鐘，PBS清洗，滴加TUNEL反應緩沖液37℃孵育60分鐘，PBS清洗，滴加PID轉換緩沖液37℃孵育30分鐘，PBS清洗，進行DAB（Diaminobenzidine，DAB））顯色。蘇木素復染，分化、反藍，脫水，透明，封片。同時制作陰性對照與陽性對照切片。TUNEL染色結果計數5個視野中的總細胞數和TUNEL陽性細胞數，以如下公式計算凋亡指數。

1.7統計分析 使用SPSS19.0統計軟件，大體解剖發現和組織學所見數據使用Fisher's確切概率法，TUNEL結果使用方差分析進行統計。認為P<0.05為有顯著性差異。

2實驗結果

2.1大鼠前胃組織形態學觀察

2.1.1大體解剖學改變 SD大鼠灌胃土木香總內酯28天后所有動物全部存活，未發現死亡。解剖后肉眼觀察發現，對照組大鼠前胃黏膜呈白色，表面光滑，黏液豐富，富有光澤，黏膜皺襞走向規則，細密而均勻。土木香總內酯給藥組大鼠前胃黏膜蒼白增厚，失去光澤，偶可見黏膜表面糜爛潰瘍。

2.1.2病理組織學改變 通過HE染色可見，對照組為正常前胃，黏膜層由4層細胞構成，基底部有一層矮柱狀基底細胞，中間層為1-2層棘細胞，棘細胞層上方有一層扁平的顆粒細胞，最表面為角化層。各層細胞分布均勻，排列整齊。土木香總內酯給藥組中，可觀察到大鼠前胃發生過角化，鱗狀上皮單純性增生與乳頭狀增生。（表1、圖1）

我們統計了所有大鼠前胃病變的發生率并進行比較。對照組大鼠均為正常胃黏膜，而土木香總內酯給藥后中，大鼠前胃黏膜中過角化與增生性病變（包括單純性增生和乳頭狀增生）的發生率顯著增加（P<0.05）。（表2）

根據HE診斷結果，我們對發生在土木香總內酯誘發的鱗狀上皮增生性病變中的凋亡情況進行了TUNEL檢測，并分析凋亡指數。與正常胃黏膜相比，增生性病變中的TUNEL陽性細胞個數少，分布分散，尤以乳頭狀增生中明顯（圖2）。

給藥期大鼠正常前胃黏膜平均AI值為23.61%;單純性增生、乳頭狀增生凋亡指數與正常前胃黏膜相比具有顯著差異（P<0.01）;其中乳頭狀增生中的凋亡指數更低。（P<0.01）（見表3、圖3）。

3討論

土木香是一味歷史悠久，使用廣泛的中藥，在多個國家的傳統醫藥中均有應用。在以往臨床應用的記載中，偶有土木香引發嘔吐的不良反應的記載，為了解該不良反應是否因土木香的主要活性成分土木香總內酯引起，我們對SD大鼠進行了土木香總內酯灌胃28天毒理學試驗。

HE結果顯示，應用土木香總內酯對SD大鼠灌胃28天后，給藥組前胃發生了過角化、單純性增生與乳頭狀增生。說明在本試驗條件下，土木香總內酯對SD大鼠具有毒性作用，毒性作用的靶器官在前胃，能誘發前胃的增生性病變。

細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種形式，它是受基因控制的主動細胞死亡模式，細胞在凋亡誘導因素的刺激下，經由外源性死亡受體途徑與內源性線粒體途徑轉導死亡信號，執行細胞凋亡。腫瘤發生的生物學基礎是細胞凋亡與增殖之間平衡的失調，凋亡不足時，細胞的死亡傾向性降低，增殖速度加快，形成增生性病變甚至腫瘤。大鼠前胃腫瘤的發生，歷經鱗狀上皮增生一鱗狀上皮乳頭瘤一鱗癌幾階段。而乳頭狀增生比單純性增生程度更嚴重，更接近鱗狀上皮乳頭瘤。為進一步探討土木香總內酯致前胃黏膜損傷作用的機制，我們用TUNEL方法檢測了大鼠前胃黏膜凋亡情況，結果發現在大鼠增生性病變中，凋亡指數隨增生性病變嚴重程度的增加而降低。在鱗狀上皮乳頭狀增生中觀察到最低的凋亡指數。這一結果說明土木香總內酯可能通過抑制前目鱗狀上皮的凋亡導致增生的發生。

土木香作為傳統中藥已有數百年的應用，但缺乏對其有效成分的毒理研究，本研究首次對土木香的主要有效成分土木香總內酯的經口毒性進行報道，并發現了毒作用靶器官及其毒性病理學改變，為土木香的安全用藥提供了毒理學評價資料。