鯷魚—小麥面筋交聯蛋白前期酶解條件的研究

方超逸 林建城

摘要：異源蛋白交聯載藥體在藥物緩釋領域將有廣闊的應用前景，本文則是以鯷魚與小麥面筋共容蛋白為原料，選取水解度最高、可溶性蛋白最高、揮發性鹽基氮最低為實驗指標來確定鯷魚蛋白與小麥面筋蛋白的酶解條件，為后期兩者的交聯構建尋找最優條件.結果表明，小麥面筋蛋白在胰酶酶解36h后，其水解度（DH）為最高12.39%，可溶性蛋白含量（PDI）也處于最高值49.03%，且揮發性鹽基氮（TVB-N）最低為1.13%；在堿性蛋白酶（Alcalase）酶作用下除水解度較低外，其他兩個指標測定值也相對滿足本次實驗的要求；因此可選擇其作用小麥面筋蛋白制備交聯反應的酶解液原料.鯷魚蛋白在自身內源酶酶解2小時后，其可溶性蛋白與揮發性鹽基氮都趨于較平緩，分別約為9.42%和1.2%；而水解度呈相對較大的上升趨勢，為了使后續實驗得到較理想結果，后期將選擇鯷魚蛋白酶解0、2h、4h、6h的酶解液分別與小麥面筋蛋白在胰蛋白酶、Alcalase酶酶解36時的酶解液進行TG交聯.

關鍵詞：鯷魚蛋白；小麥面筋蛋白；酶解；最優條件

中圖分類號：TS201.1 文獻標識碼：A 文章編號：1673-260X（2019）03-0042-06

1 概述

隨著生物技術及緩釋技術領域的不斷拓展，異源蛋白交聯載藥體在藥物緩釋領域將有廣闊的應用前景.國內外的研究報道中，雖然也有一些生物大分子在藥物載體構建的報道[1]，但目前對于構建異源蛋白藥物載體的研究和報道相當有限，在有限的報道研究也存在不夠深入、制備方法也不夠全面的問題，藥物載體的靶性不夠明確，所以有待于尋求更新穎安全的技術方法制備更能滿足要求的藥物載體.

本課題組擬利用轉谷氨酰胺酶（TGase）將鯷魚與小麥面筋共容蛋白酶解物共價交聯構建藥物的核殼材料，分析比較交聯前后物質結構和性質的變化，尋找交聯構建的最優條件.而本文研究的目的是以鯷魚與小麥面筋共容蛋白為原料，對鯷魚蛋白和小麥面筋蛋白酶解條件進行初步的確定，為后期兩者的交聯構建尋找最優條件.

鳀魚是鳀屬（Engraulis）魚類的統稱，是世界上單一漁業品種產量最高的魚種，主要分布于南北半球的溫帶水域，我國的黃海和東海海域含有豐富的鳀魚資源.鯷魚營養價值高，其富含蛋白質，蛋白質含量達15%-20%，各種必需氨基酸齊全.其中利用酶水解加工所得的鳀魚制品各方面性能都較為優越.鯷魚酶解物含有豐富的必需氨基酸，占總氨基酸的38%，此外還含有較多的賴氨酸（Lys）[2].當前對酶解鯷魚的研究主要集中在兩個方面[3]：（1）確定酶解的條件及其產物的功能特性.（2）營養價值及生理活性.迄今為止，基于現今鳀魚資源的深度加工利用尚處于空白的階段，本次實驗選擇鯷魚蛋白的酶解物為研究對象，確定鳀魚的酶解條件，以期研究獲得更廣闊的利用途徑.

小麥面筋蛋白又稱谷朊粉[4]，是從小麥粉提取出來的天然蛋白質，屬于小麥淀粉加工的副產物.谷朊粉的主要成分是蛋白質，含量約為70%-80%，且氨基酸組成比較齊全，鈣磷鐵等礦物質含量較高，此外還含有少量淀粉、纖維素、糖、脂肪等.在我國，谷朊粉的研究仍處于初級階段，主要應用在食品領域，具有較高附加值的利用幾乎沒有，因此開發谷朊粉新用途勢在必行.而溶解度是小麥面筋蛋白應用于食品生產中首要考慮的問題.原因是溶解度對面筋蛋白的提取、純化、分離及加工條件的確定至關重要.通過改性修飾來提高面筋蛋白溶解度和相應的功能特性是目前一項重要的研究工作.現今面筋蛋白的改性方法研究主要集中在物理方法、化學方法、酶法及基因工程法這四個方面[5].目前應用較為廣泛的是酶解法.

鯷魚蛋白含有豐富的賴氨酸，可以彌補小麥面筋蛋白的營養缺陷，并且有利于形成G—L鍵，本次課題研究的目的是以鯷魚與小麥面筋共容蛋白為原料，對鯷魚蛋白和小麥面筋蛋白酶解條件進行初步的確定，為后期兩者的交聯構建尋找最優條件.課題研究擬開展的幾個主要方面內容：

（1）小麥面筋蛋白酶解條件的確定以及對其水解度、蛋白質回收率、揮發性鹽基氮的測定.

（2）鯷魚蛋白酶解條件的確定以及對其水解度、蛋白質回收率、揮發性鹽基氮的測定.

目前國內外尚無異源蛋白水解物共價交聯構建藥物載體控釋體系的研究報道，并且對于生物大分子納米藥物載體的研究尚處在基礎階段.因此，通過本研究的工作，可促進谷物和海洋低值蛋白綜合利用與開發，對其在生物醫院領域進行高附加值開發具有重要的意義.

2 材料與方法

2.1 實驗材料與儀器設備

市售谷朊粉、鮮鳀魚（莆田市永輝超市提供），各種酶制劑及儀器如表2-1和2-2所示.

2.2 實驗方法

2.2.1 鯷魚酶解液的制備

由于鯷魚自身含有較為豐富的內源自溶酶，故在一定條件下會水解自身蛋白.為了避免添加外源酶而增加成本，因此本次研究選擇利用鯷魚內源酶進行蛋白的酶解.

2.2.1.1 樣品前處理

鯷魚去掉頭、尾、刺、鱗，挖出內臟，用清水洗凈，取肉，攪成魚糜，用密封袋分裝，冷凍保藏，備用.

2.2.1.2 鯷魚酶解方法

將魚糜與水按質量比1：1混合，酶解溫度為55℃，自然pH值.酶解時間設置為0h、2h、4h、6h、8h.酶解不同時間后，取一定量的酶解液，沸水滅酶10min，冷卻后，4℃離心20min（10000r/min），取上清液，4℃冰箱保存備用.

2.2.2 小麥面筋蛋白酶解液的制備

本次研究利用各種蛋白酶對其進行酶解制備小麥面筋蛋白酶解物，測定分析后從而確定酶解條件，為后面藥物載體的構建做好前期的材料準備.

2.2.2.1 檸檬酸脫酰胺處理

稱取6.00g檸檬酸，用蒸餾水溶解，定容于1000 mL的容量瓶，配置成質量濃度0.6%的檸檬酸溶液.稱取10g小麥面筋蛋白粉與100mL檸檬酸溶液混合均勻，配制一定濃度的小麥面筋蛋白分散懸浮液，并制作五組平行實驗.

2.2.2.2 小麥面筋蛋白酶解方法[6]

將上述進行脫酰胺處理后的五組實驗用0.1 mol/L的NaOH調pH分別為6.0、8.5、7.0、9.0、9.0.置于50℃水浴恒溫振蕩器30min.取出按調節的pH順序分別添加木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶（Alcalase）、風味蛋白酶、胰蛋白酶、水解蛋白酶（Novozyme），添加酶量為1%（按蛋白質質量計）進行酶解.酶解時間設置為0h、12h、24h、36h、48h.酶解不同時間后，取一定量的酶解液，沸水滅酶10min，冷卻后，4℃離心15min（10000r/min），取上清液，4℃冰箱保存備用.

2.2.3 水解度的測定（Degree of hydrolysis，DH）[7]

蛋白質的水解度（DH）是指蛋白質水解中斷裂的肽鍵數占肽鍵總數的百分比，本實驗采用茚三酮法測定.

制備茚三酮顯色劑：茚三酮0.5g，果糖0.3g，Na2HPO4·10H2O 10.0g，KH2PO4 6.0g，定容至100mL；

標準曲線的繪制：準確稱取0.1000g干燥過的甘氨酸溶解后定容至100mL，取出2.00mL定容至100mL得20ug/mL的溶液.取12支試管分兩組，分別加入0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL的標準溶液，用蒸餾水補足到2mL；加入1.00mL顯色劑，搖勻后沸水浴中加熱15min；冷卻后加入5.00mL 40%乙醇溶液，混勻，放置15min；用1cm比色杯以空白管調零于570nm處測定吸光度.取兩組測定的平均值，以光吸收值為橫坐標，蛋白質的含量（ug/mL）為縱坐標繪制標準曲線.

水解蛋白液中-NH2基的測定：取水解蛋白液0.5mL定容至50.0mL；取0.40mL稀釋液于試管中，加入1.60mL蒸餾水、1.00mL顯色，搖勻后沸水浴中加熱15min；冷卻后加入5.00mL 40%乙醇溶液，混勻，放置15min；每種樣液做兩次平行，同時做空白試驗，以空白管調零于570nm處測定吸光度.利用標準曲線計算水解蛋白液中-NH2基的含量（umol/mL）.

DH=（h-h0）/htot*100%

DH=（Y/（6.25*N）-h0）/htot*100% 公式2-1

h&Y-單位質量蛋白質中被水解的肽鍵的量（mmol/g）；

htot-單位質量蛋白質中肽鍵的總量（mmol/g）；對于某一特定蛋白質來講是一個常數，查得小麥蛋白htot=9.2mmol/g；

N-氮的摩爾質量，14.008g/mol.

2.2.4 可溶性蛋白的測定[8]

標準蛋白質溶液：準確稱取標準的結晶牛血清蛋白0.5g，加蒸餾水溶解后定容至50mL，配制成10mg/mL的標準蛋白質溶液.

雙縮脲試劑：準確稱取硫酸銅1.50g，酒石酸鉀鈉6.0g，用500mL蒸餾水溶解，在攪拌下加入300mL 10%NaOH溶液，用水稀釋到1000mL，貯存于塑料瓶中（或內壁涂以石蠟的瓶中）.

標準曲線的繪制：取12支試管分兩組，分別加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的標準蛋白質溶液，用水補足到1.0mL；加入4mL雙縮脲試劑，充分搖勻，在室溫下放置30min；用未加蛋白溶液的一組作為空白對照液，于540nm處進行比色測定.取兩組測定的平均值，以光吸收值為橫坐標，蛋白質的含量（mg/mL）為縱坐標繪制標準曲線.

水解液中可溶性蛋白的測定：取水解蛋白液0.2mL，加入蒸餾水補足到1mL；加入4mL雙縮脲試劑，充分搖勻，在室溫下放置30min；每種樣品做兩組平行，同時做空白試驗，以空白管調零于540nm處測定吸光度.利用標準曲線計算水解蛋白液中可溶性蛋白的含量（mg/mL）.

小麥蛋白的溶解度用分散指數（PDI）來表示：

PDI=（C*V*N）/W*100% 公式2-2

C-被測蛋白質的濃度，mg/mL；

V-被測蛋白質總體積，mL；

N-稀釋倍數；

W-蛋白質樣品的質量，g.

2.2.5 揮發性鹽基氮的測定[9]

分析使用儀器：DWS-296型氨氮分析儀，DWS-296-1型測量單元，電極：pNH3-3型氨電極.

2.2.5.1 溶液的配制

無氨水制備：按每升去離子水中加入0.1mL硫酸（r=1.84g/mL）的比例，用一個全玻璃裝置進行蒸餾.最初蒸餾的50mL餾出液廢棄不要，余下的餾出液收集在有密閉玻璃塞的玻璃容器中，每升餾出液加入10g強酸性離子交換樹脂（氫型）.

清洗劑：將0.5克清洗劑，轉入1000mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度.

（濃）掩蔽劑：將800g掩蔽劑，轉入1000mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度.

（?。┭诒蝿簩?0g掩蔽劑，轉入1000mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度.

堿化劑：將10g氫氧化鈉，轉入1000mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度.轉移到密封性能良好的聚乙烯瓶中，密閉保存.

氨氮標準母液（1000mg/L）：稱?。?.819±0.004）g氯化銨（NH4Cl，經100℃～105℃干燥2h）轉入1000mL容量瓶中，加無氨水稀釋至刻度.配制成的氨氮標準母溶液與有證氨氮標準溶液比對相對誤差應不超過±1.5%.

100mg/L氨氮標準溶液：吸取100.0mL氨氮標準母液，轉入1000mL容量瓶中，加無氨水稀釋至刻度.

15.00mg/L氨氮標準溶液：吸取15.00mL氨氮標準母液，轉入1000mL容量瓶中，加無氨水稀釋至刻度.

1.50mg/L氨氮標準溶液：吸取1.50mL氨氮標準母液，轉入1000mL容量瓶中，加無氨水稀釋至刻度.

2.2.5.2 實驗步驟

利用二點標定法進行測定：

樣品測量：

儀器完成二點標定及空白清洗后，將（清洗劑/樣品）吸管用蒸餾水沖洗干凈后放入樣品混合溶液中（取50.00mL樣品溶液加（濃）4.00mL掩蔽劑混勻），泵開關置“開”，（清洗/測量）開關置“測量”，待儀器顯示屏上的讀數趨于穩定，記錄該讀數，即完成樣品濃度測量.

3 結果與討論

3.1 DH的測定結果

3.1.1 茚三酮法DH的標準曲線

以吸光度為橫坐標，甘氨酸的濃度為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示，得出水解蛋白液中-NH2基的量Y（mg/L）=22.427A-0.0923（R2= 0.9993）；因甘氨酸的分子量為75.07，所以式子可轉化為Y（umol/L）=0.2987A-1.23*10-3，Y用于DH的計算.

3.1.2 酶解時間對鯷魚蛋白水解度的影響

鯷魚在自身內源酶酶解后分解為小分子的肽、氨基酸，水解度的高低可反映蛋白質的降解程度.圖2所示的是鯷魚蛋白隨不同的酶解時間水解度的變化情況.從圖中可知，隨著酶解時間的的增加，鯷魚蛋白的水解度越來越高.在反應初期（0-2h內），水解度上升的幅度最大，DH由3.16%上升至6.43%.這是因為酶的催化速度會受到產物的影響，反應初期，產物的抑制作用小，水解度上升的較快，隨著反應時間的延長，酶活力逐漸下降，且游離的小分子肽和氨基酸等產物增多，產物的抑制作用增加，水解度上升的趨勢較慢，最后由于底物的減少，水解度基本保持不變，但總體還是呈現上升的動態.

3.1.1 不同蛋白酶對小麥面筋蛋白水解度的影響

由圖3可知：對小麥面筋蛋白進行深度酶解，胰蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的DH%最高，高達13.12%，其次是風味蛋白酶12.56%，且隨時間的延長水解度上升的趨勢都較為顯著.堿性蛋白酶（Alcalase）酶解的水解度最低.在胰蛋白酶作用下，反應12h內，水解度上升的速率最快，隨著反應時間的延長，水解度趨于平緩，水解36h后，水解度增加的幅度不大，基本保持不變.

3.2 可溶性蛋白的測定結果

3.2.1 可溶性蛋白質測定的標準曲線

以吸光度為橫坐標，蛋白質濃度為縱坐標，繪制標準曲線見圖4，得到回歸方程為：Y=20.185X -0.0884（R2=0.9993）.

3.2. 2酶解時間對鯷魚蛋白溶解度（PDI）的影響

如圖5可知：隨著酶解時間的增加，鯷魚蛋白溶解度逐漸上升，在0-2h內變化得最明顯，溶解度由5.14%變為9.42%，在反應時間為2-8h內，溶解度上升較緩慢，趨于平穩.

3.2.3 不同蛋白酶對小麥面筋蛋白PDI%的影響

小麥面筋蛋白主要是麥谷蛋白和麥醇溶蛋白，它們在中性條件下幾乎不溶，在酶解的過程中，溶液的pH會發生變化，從而溶解度也會相應地發生改變.酶解物溶解度提高的原因主要是酶解過程中分子量減小，暴露更多的離子化氨基和羧基，端基極性基團增加，提高了酶解產物的親水性，從而大大增加了蛋白質的溶解度.

由圖6可見：胰蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的PDI%最高，高至53.37%，其次是堿性蛋白酶（Alcalase）47.35%，接下來依次是水解蛋白酶（Novozyme）、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶.在酶解初期（0-12h內）小麥面筋蛋白的溶解度上升速率最大，隨后曲線都趨于平緩.可能在反應初期，溶液的pH變化不大，對蛋白溶解度的影響較小，而隨著酶解的進行，溶液pH變化較明顯，對蛋白溶解度的影響增大，所以蛋白溶解度的變化較為緩慢.在風味蛋白酶的作用下，酶解的pH為7.0，小麥面筋蛋白在此pH中，溶解度極小，在酶解過程pH的變化中，蛋白質的溶解度也是不高，所以相對于其他酶的作用下，其酶解的小麥面筋蛋白的溶解度最低.

3.3 揮發性鹽基氮的測定

3.3.1 酶解時間對鯷魚蛋白的揮發性鹽基氮的影響

如圖7所示：酶解時間0-2h內，鯷魚蛋白的揮發性鹽基氮上升的速度較為緩慢，由0.58g/mL增加到0.75g/mL，而在2-4h內，上升的趨勢較明顯，揮發性鹽基氮由0.75g/mL增加至1.20g/mL，其后，曲線趨于平緩，酶解液中的TVB-N值基本保持不變.由于反應初期，鯷魚蛋白在自身內源酶作用，蛋白質被分解產生具有揮發性的氨以及胺基等堿性含氮物質，所以測得的揮發性鹽基氮逐漸增加；隨著酶解的進行，酶解液中微生物不斷增多，在某些細菌的作用下，加速了蛋白質的分解，導致在反應2-4h內揮發性鹽基氮上升的速率明顯增加；隨著酶解底物的減少，到最后曲線趨于平緩.

3.3.2 不同蛋白酶對小麥面筋蛋白揮發性鹽基氮的影響

由圖8可知：隨著酶解的進行，小麥面筋蛋白酶解液中的揮發性鹽基氮的含量基本呈現上升的趨勢.在酶解12小時內，胰酶的上升速率最快，在酶解12小時后趨于平緩，基本保持不變，說明胰酶在反應初期的酶解活性最高，隨著酶解過程中溶液pH的變化以及底物含量的減少，揮發性鹽基氮含量上升速率較少，到最后保持穩定；在木瓜蛋白酶的作用下，酶解12小時后仍然處于較大的上升速率直至24后，曲線趨于平穩，上升幅度很小，說明木瓜蛋白酶在反應24h內能保持較高的的酶活；而在堿性蛋白酶（Alcalase）酶解下，曲線一直呈現緩慢上升的趨勢，在酶解36小時時與胰酶有一個交點，此時兩種酶作用的酶解液中揮發性鹽基氮含量相同，說明堿性蛋白酶（Alcalase）在整個反應過程中，酶活最低，分解蛋白速度最慢，直至36h后才出現緩慢的提升，此時揮發性鹽基氮高于胰酶作用.

4 結果分析

由于轉谷氨酰胺酶是催化蛋白質中賴氨酸殘基上的ε-氨基和谷氨酰胺殘基上的γ-羥酰氨基之間結合反應的酶，所以蛋白的水解度越高，肽鍵斷裂的程度越高，鯷魚蛋白暴露出賴氨酸殘基上的ε-氨基與小麥面筋蛋白暴露出的谷氨酰胺殘基上的γ-羥酰氨基將增多，有利于交聯作用；且可溶性蛋白含量高有利于增加酶解液中氨基酸的溶度，促進交聯反應；而酶解過程產生的揮發性鹽基氮主要是氨以及少量伯胺和叔胺等物質，會阻礙交聯的進行[10].因此本次實驗選取水解度最高、可溶性蛋白最高、揮發性鹽基氮最低為實驗指標來確定鯷魚蛋白與小麥面筋蛋白酶解條件.對于小麥面筋蛋白酶解過程，酶解36h時，其水解度、可溶性蛋白都趨于較大值，而此時揮發性鹽基氮處于較低值.小麥面筋蛋白在各種蛋白酶的作用下酶解36h的水解度、可溶性蛋白含量、揮發性鹽基氮含量如表1所示.

由表1可看出，小麥面筋蛋白在胰酶酶解36h后，其水解度與可溶性蛋白含量都處于最高值，且揮發性鹽基氮最低.在Alcalase酶作用下除水解度較低外，其它兩個指標測定值也相對滿足本次實驗的要求，因此可選擇其作用小麥面筋蛋白制備交聯反應的酶解液原料.所以初選擇小麥面筋蛋白的酶解的酶的種類為胰酶、堿性蛋白酶（Alcalase），酶解時間為36小時，其余酶解條件與2.2.2所示一樣.

由于鯷魚蛋白在自身內源酶酶解2小時后，其可溶性蛋白與揮發性鹽基氮都趨于較平緩，而水解度呈相對較大的上升趨勢，為了使后續實驗得到較理想結果，因此在后期的研究中將選擇鯷魚蛋白酶解0、2h、4h、6h的酶解液分別與小麥面筋蛋白在胰蛋白酶、堿性蛋白酶（Alcalase）酶解36時的酶解液進行TG交聯.

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