電離輻照損傷對小鼠脾臟組織核糖體信號通路的影響

何 清，李 敏，唐文誠，易輝燕，王 蕾，王繼生,

[1. 西南醫科大學藥學院，四川 瀘州 646000；2. 綿陽市第三人民醫院(四川省精神衛生中心)，四川 綿陽 621000]

隨著科學技術和社會的發展，電離輻射損傷受到人們的廣泛關注，如工業輻射、醫療輻射、人工輻射以及天然來源的輻射，包括太陽、宇宙射線、地殼中存在的放射性核素等[1]。電離輻射主要是一種由高速帶電的粒子(α、β、質子)和不帶電的粒子(X射線、γ射線、中子)產生[2]。電離輻射可引起放射性疾病，其中以消化系統、免疫系統、神經系統和造血器官的反應最為明顯[3]。電離輻射損傷的主要靶點是DNA。輻射可使自由基電產生增加、重要功能基團破壞、蛋白質和膜的脂質結構功能發生變化,輻射可激活細胞的凋亡程序導致細胞凋亡[4]。此外，過量的輻射還會造成基因突變、致癌、致畸等[5]。

脾臟是機體免疫系統中最大的免疫器官，具有大量的B淋巴細胞和巨噬細胞，脾臟可產生免疫球蛋白和補體蛋白等免疫物質，從而發揮免疫功能[6]。脾臟對電離輻射敏感，是輻射損傷最常見的器官之一。電離輻照可致免疫系統的細胞、組織、器官受損。2 Gy X射線全身照射小鼠后，可誘導小鼠脾臟出現典型的淋巴細胞凋亡，使脾臟白髓及紅髓的細胞凋亡均增加[7]。電離輻照破壞DNA雙鏈，間接產生活性氧，使小鼠B淋巴細胞凋亡，可能是導致脾臟組織受損的重要原因[8]。因此，研究電離輻射對小鼠脾臟組織損傷具有重要意義。比較蛋白質組學是蛋白質組學中的重要研究策略，通過對整體蛋白質表達變化的分析，從而發現蛋白質組間的差異蛋白[9]。ITRAQ聯合LC-MS/MS技術可對多達8種樣品進行定量研究，可同時分離和篩選成百上千的差異蛋白，最大化的獲得蛋白質的生物學功能[10]。

1 材料

1.1 實驗動物清潔級昆明種♂小鼠20只，體質量(20±2)g，購自第三軍醫大學實驗動物中心，動物生產許可證號為：SCXK(軍)2012-0011。實驗室環境為溫度(22～26) ℃，濕度44%～65%，光照與黑暗交替出現，光照12 h,黑暗12 h。所有小鼠均給予正常的飲食、飲水飼養，以適應環境1周。該實驗已通過綿陽市第三人民醫院倫理委員會審核通過，均遵守實驗動物管理規范照料和使用原則。

1.2 試劑與儀器ITRAQ標記試劑盒(美國ABSCIEX公司)；BCA試劑盒(碧云天公司)；蛋白裂解液(美國Bio-Rad公司)。LC-6AD型高效液相色譜儀(日本島津)；TRIPLE TOF5600質譜儀配套軟件(美國ABSCIEX公司)；WFZUV-2100型可見紫外分光光度計(尤尼柯)；RVT4104型低溫冷凍干燥器(美國Thermo Fisher)。

2 方法

2.1 動物分組將實驗小鼠按照隨機分組的原則分為正常組和輻射組，每組10只。電離輻照之前，所有小鼠均給予正常的飲食、飲水。

2.2 電離輻照損傷小鼠模型輻射組小鼠常規環境下飼養1周后，將小鼠放置于自制的紙盒內，給予5 Gy60Co γ射線全身輻照小鼠1次，輻照率為1.73 Gy·min-1[11]。輻照完成后，繼續給予正常組和輻射組小鼠正常的飲食、飲水。

2.3 組織取材輻照完成7 d后，用3.5%的水合氯醛麻醉小鼠，在無菌隔離環境下解剖小鼠，取出脾臟組織，用0.9%的滅菌生理鹽水反復灌注清洗脾臟組織后，迅速置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存。

2.4 脾臟組織蛋白質的提取將1 μL蛋白酶抑制劑、5 μL磷酸酶抑制劑和10 μL PMSF加入裂解緩沖液中混合均勻，分裝于2支玻璃勻漿器中并置于冰上預冷。將凍存的小鼠脾臟組織從液氮中取出，每組3只，PBS清洗后，按組別放入玻璃勻漿器中，加適量液氮研磨，再加入預冷的裂解緩沖液，手動充分研磨脾臟組織至均質勻漿。冰上超聲破碎脾臟組織，功率80 W，超聲0.8 s，關閉0.8 s，共計3 min。加入5倍體積預冷的丙酮溶液混勻后，靜置于-20 ℃環境中沉淀4 h，再4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，取沉淀，反復操作，直至沉淀變為白色，-80 ℃凍存。

2.5 ITRAQ標記① 蛋白質的溶解、定量：取凍存的2組樣品各20 μL，并稀釋至可檢測的濃度范圍。采用Bradford法測定蛋白質含量，調整蛋白質的濃度。② 蛋白還原烷基化及酶切：利用二硫蘇糖打開二硫鍵及碘代乙酰胺烷基化二硫鍵使蛋白質充分變性。③ 蛋白標記：平衡ITRAQ試劑至室溫后,離心至管底，并加入150 μL異丙醇溶解。取上述酶解產物50 μL至新的離心管中，加入處理好的ITRAQ試劑，室溫反應2 h，后加入水，讓有機相降低至50%以下以終止反應，混合后、旋渦振蕩、離心后真空冷凍干燥，將兩組蛋白各進行標記，將正常組標記為113，輻射組標記為119。④ SCX分級：將上述標記好的多肽混合物用流動相A(150 μL)經復溶、旋渦振蕩處理后，12 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液上樣，流速0.8 mL·min-1，按不同的參數梯度洗脫，據峰形和時間共收集到50個梯度，冷凍抽干后保存待用。

2.6 質譜鑒定各組蛋白質樣品用Q-TOF(質譜TOF；MS參數m/z：350～1 500；time：0.25 s)進行iTRAQ標記樣品的質譜信息檢測，獲得ITRAQ標記肽段的序列，再根據肽指紋圖譜鑒定出相應的蛋白質。兩ITRAQ離子的峰面積比值可以反映樣品中多肽和蛋白質的相對含量。

Fig 1 Differential protein Venn diagram between normal group and ionizing radiation group

A represents proteins identified in the first assay; B represents proteins identified in the second assay. a: Differential proteins between normal group and ionizing radiation group; b: 35 up-regulated differential expressed proteins in the ionizing radiation group compared with the normal group; c: 92 down-regulated differential expressed proteins in the ionizing radiation group compared with the normal group.

2.7 生物信息學鑒定① 采用Perseus1.5.5.3的Significance A方法進行差異蛋白篩選，以P<0.05且FC>1.5或FC<0.667進行差異蛋白篩選。對篩選到共同上調和共同下調的差異蛋白，作為最終候選的差異蛋白并進行功能分析。② 利用uniprot數據庫分析差異蛋白的分子功能及生物學過程，利用分析軟件DAVID 6.8對差異蛋白進行生物過程、分子功能注釋和細胞成分分析。③ 利用KEGG Pathway數據庫對差異蛋白所涉及的通路進行注釋，尋找差異蛋白中顯著性富集的通路(P<0.05)，確定差異蛋白參與最主要的生物學途徑和通路。

3 結果

3.1 蛋白質鑒定結果經重慶醫科大學生命科學院ITRAQ技術平臺進行蛋白質組學測定,2次技術重復所鑒定到的差異蛋白質維恩分析結果見Fig 1。本實驗在正常組與輻射組中共鑒定到129個差異蛋白，與正常組比較，輻射組有35個蛋白質表達上調，92個蛋白質表達下調。差異蛋白的網絡分析圖見Fig 2。其中，紅色代表上調的差異蛋白，綠色代表下調的差異蛋白，線越粗代表兩蛋白質之間的相互作用越強。

3.2 生物學功能分析通過DAVID富集分析系統對實驗獲得的129個差異蛋白進行GO富集分析，研究這些差異蛋白的功能，結果見Fig 3。BP分析發現，這些差異蛋白大多參與翻譯、細胞質翻譯、核小體組裝、核小體定位和肌動蛋白絲覆蓋。MF分析得出這些差異蛋白主要與核糖體的結構組成、RNA結合、染色質DNA結合、rRNA大核糖體亞基結合有關。CC分析揭示，這些差異蛋白分布在細胞核、核糖體、細胞內核糖體蛋白復合體、細胞質大核糖體亞基、細胞質小核糖體亞基、核糖體亞基上。

Fig 2 Network analysis of differentially expressedproteins in spleen tissues of mice in normalgroup and ionizing radiation group

3.3 KEGG通路注釋結果將正常組與電離輻射組小鼠的脾臟組織鑒定到的差異蛋白，運用DAVID 6.8分析軟件進行KGEE Pathway富集分析，發現有57個差異蛋白，參與了17條生物信號通路(P<0.05),其中有50個差異蛋白表達上調，7個差異蛋白表達下調。差異蛋白富集最明顯的10條通路見Fig 4。從圖中發現，差異蛋白主要富集在核糖體、細胞外基質受體的相互作用、蛋白質消化與吸收、黏著斑、PI3K-Akt信號通路、阿米巴病、小細胞肺癌、系統性紅斑狼瘡、癌癥途徑、抗原處理和呈現的信號通路中。

本實驗發現，富集在核糖體信號通路中的差異蛋白質有37個，信號通路圖見Fig 5。有36個差異蛋白質表達下調，分別是60S核糖體蛋白L34(Rpl34)、60S核糖體蛋白L27(Rpl27)、60S核糖體蛋白L21(Rpl21)、60S核糖體蛋白L14(Rpl14)、60S核糖體蛋白L23(Rpl23)、60S核糖體蛋白L6(Rpl6)、60S核糖體蛋白L10(Rpl10)、60S核糖體蛋白L13(Rpl13)、60S核糖體蛋白L7(Rpl7)、60S核糖體蛋白L27a(Rpl27a)、60S核糖體蛋白L8(Rpl8)、60S核糖體蛋白L31(Rpl31)、40S核糖體蛋白S8(Rps8)、40S核糖體蛋白S9(Rps9)、40S核糖體蛋白S4(Rps4x)、40S核糖體蛋白S26(Rps26)、40S核糖體蛋白S3a(Rps3a1)、核糖體蛋白L4(Rpl4)、核糖體蛋白S15A(Rps15a)、核糖體蛋白L15(Rpl15)、核糖體蛋白L19(Rpl19)、核糖體蛋白L28(Rpl28)、核糖體蛋白(Rpl10a)、核糖體蛋白16(Rps16)、MCG10725, 異構體CRA a(Rps25)、MCG13615, 異構體CRA a(Rpl3)、MCG23000, 異構體CRA b(Rps18)、MCG23455, 異構體CRA e(Rpl13a)、MCG132477, 異構體 CRA a(Rpl18)、無特征性蛋白(Rps2)、無特征性蛋白(Rpl3)、無特征性蛋白(Rps23)、蛋白MCG12304(Rpl22)、蛋白MCG10205(Rps13)、Rpl17蛋白(Rpl17)、Rpl7a蛋白(Rpl7a)，有1個差異蛋白的表達上調，是MCG10168蛋白(Rplp1)。進一步利用String10.5和Cytoscape 3.6.1制作差異蛋白相互作用網絡圖，見Fig 6，發現這些差異蛋白之間是相互聯系的，且相互作用關系復雜。

Fig3GOfunctionenrichmentanalysisofdifferentiallyexpressedproteinsinspleentissuesofmiceinnormalgroupandionizingradiationgroup
A: Biological process categories. 1: translation; 2: cytoplasmic translation; 3: nucleosome assembly; 4: porphyrin-containing compound biosynthetic process; 5: protein heterotrimerization; 6: collagen-activated tyrosine kinase receptor signaling pathway; 7: histone H3-K27 trimethylation; 8: nucleosome positioning; 9: histone H3-K4 trimethylation; 10: action filament capping. B: Molecular function categories. 1: structural constituent of ribosome; 2: poly(A) RNA binding; 3: chromatin DNA binding; 4: extracellular matrix structural constituent; 5: RNA binding; 6: 5.8SrRNA binding; 7: mRNA binding; 8: 5SrRNA binding; 9: platelet-derived growth factor binding; 10: large ribosomal subunit rRNA binding. C: Cellular component categories. 1: ribosome; 2: intracellular ribonucleoprotein complex; 3: cytosolic large ribosomal subunit; 4: extracellular matrix; 5: extracellular exosome; 6: focal adhesion; 7: cytosolic small ribosomal subunit; 8: proteinaceous extracellular matrix; 9: nucleolus; 10: small ribosomal subunit.

Fig 4 Distribution of top ten sites in enriched KEGGsignaling pathway of differential expressed proteins in spleentissues of mice in normal group and ionizing radiation group

1: ribosome; 2: EMC-receptor interaction; 3: protein digestion and absorption; 4: focal adhesion; 5: PI3K-Akt signaling pathway; 6: amoebiasis; 7: small cell lung cancer; 8: systemic lupus erythematosus; 9: proximal tubule bicarbonate reclamation; 10: antigen processing and presentation.

Fig 5 Enrichment of differentially expressed proteins in spleen tissues of micein ribosome signaling pathway in normal group and ionizing radiation group

Fig 6 Diagrams of 37 differential protein interactionnetwork in ribosome signaling pathway betweennormal group and ionizing radiation group

4 討論

蛋白質是生命活動的承擔者，是構成生物體細胞和組織的重要物質，生物體的一切生命活動都離不開蛋白質的參與。蛋白質的生物合成受外界環境因素的影響，如溫度、pH、離子強度、超聲波、紫外線、X射線、輻射等。已有研究表明，電離輻射可導致小鼠的造血細胞、免疫細胞、生殖細胞凋亡，其機制與細胞周期異常、基因表達異常、蛋白質的合成異常有關[12]，此外,電離輻射可致機體分子水平發生變化，如損傷DNA分子(堿基發生變化及DNA雙鏈發生斷裂)、蛋白質的結構發生破壞、酶的分解代謝速度加快等；細胞水平上可致細胞發生凋亡、染色體發生突變等[13]，這對目前研究電離輻射對機體的損傷作用機制具有重要的意義。

核糖體是蛋白質合成的重要場所，是機體細胞中重要的細胞器。核糖體的主要成分是蛋白質和RNA。真核生物的核糖體由60S大亞基和40S小亞基共同構成，其中，60S大亞基約有49種蛋白質和3種rRNA(28S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA)，40S小亞基約有33種蛋白質和1種rRNA(18S rRNA)。在蛋白質翻譯前，40S核糖體小亞基與mRNA結合后，再與60S核糖體大亞基結合，共同構成完整的核糖體，從而發揮核糖體的正常功能。蛋白質生物合成這一過程主要由核糖體蛋白、酶、蛋白質因子、tRNA和mRNA等的共同參與。

核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)是核糖體最主要的成分，廣泛分布于各種組織中，在核糖體的翻譯過程中發揮著重要的作用。它促使核糖體RNA的折疊，從而執行蛋白質的翻譯功能，在蛋白質的合成中發揮重要作用。除此之外，核糖體蛋白還具有調控基因轉錄、參與核糖體的結構組成、調控mRNA翻譯、影響細胞分化、增殖和凋亡等作用[14]。本實驗研究發現，核糖體信號通路中所涉及的差異蛋白，有7個差異蛋白都屬于核糖體蛋白類，分別是Rpl4、Rps15a、Rpl15、Rpl19、Rpl28、Rpl10a、Rps16，這些差異蛋白共同參與了核糖體的結構組成，在蛋白質的翻譯過程中發揮著重要的作用，其中，Rps15a還參與了細胞周期的正向調控，Rpl10a與細胞質的翻譯有關，Rpl19、Rpl10a還與mRNA結合有關。在電離輻照小鼠脾臟組織中，這些差異蛋白質表達下調，將影響脾臟組織蛋白質的生物合成，從而影響脾臟的正常生理功能。

此外，核糖體信號通路所涉及的差異蛋白中，有12個蛋白屬于60S核糖體大亞基蛋白，分別是Rpl34、Rpl27、Rpl21、Rpl14、Rpl23、Rpl6、Rpl10、Rpl13、Rpl7、Rpl27a、Rpl8、Rpl31。其中，Rpl34、Rpl27、Rpl10、Rpl13、Rpl27a、Rpl31參與了核糖體的結構組成和蛋白質的翻譯過程，Rpl27參與蛋白的翻譯及rRNA的翻譯過程，Rpl8參與細胞對神經生長因子刺激反應、細胞質翻譯過程，Rpl14參與RNA加工和結合、核糖體大亞基的生物形成，Rpl23參與細胞周期阻滯的負調控、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的負調控、細胞增殖的正向調控、基因表達的正向調控、p53類介質對信號轉導的正向調控、參與核糖體的結構組成，這些差異蛋白表達下調，蛋白質在核糖體上的翻譯受阻，從而影響脾臟細胞的正常生理功能。

在核糖體信號通路有5個差異蛋白屬于40S核糖體小亞基蛋白，分別是Rps8、Rps9、Rps4x、Rps4x、Rps3a1，這些差異蛋白都參與了核糖體的結構組成及蛋白質的翻譯過程。其中，Rps9參與細胞周期的正向調控、細胞質翻譯的正向調控，Rps3a1還與細胞的分化有關，它們表達下調影響核糖體的正常功能，影響細胞周期的正常調控。

在核糖體信號通路中,Rps25、Rpl3、Rps18、Rpl18、Rpl13a、Rpl18、Rps2、Rps23、Rpl22、Rps13、Rpl17、Rpl7a差異蛋白表達下調，其中Rps18、Rpl13a、Rpl18、Rps2、Rps23、Rpl3、Rpl17、Rpl7a參與了核糖體的結構組成及翻譯過程，在電離輻射中這些差異蛋白表達下調，影響核糖體的正常功能及蛋白質的翻譯過程；Rps25、Rpl3、Rpl22、Rps13、Rplp1在核糖體信號通路中的功能尚不明確，這些差異蛋白會不會影響核糖體的正常功能及蛋白質的生物合成，影響小鼠脾臟組織細胞的正常生理功能，值得我們進一步研究。

本實驗發現，在電離輻照小鼠脾臟組織核糖體信號通路中，核糖體蛋白、60S核糖體大亞基蛋白以及40S核糖體小亞基蛋白及其它蛋白在電離輻照后的小鼠脾臟組織中出現低表達，影響了核糖體的正常生理功能，從而影響蛋白質的生物合成。表明電離輻照可能導致核糖體的功能異常，使蛋白質的合成受阻，繼而影響脾臟細胞的正常生理功能。本實驗研究表明，核糖體對機體蛋白質的合成至關重要，通過對核糖體信號通路的研究，將有助于我們深入了解電離輻照后小鼠脾臟組織蛋白質合成障礙的機制，為電離輻照損傷尋找新靶點提供參考依據。

(致謝：感謝中國工程物理研究院核物理與化學研究所對動物造模提供幫助，感謝綿陽市第三人民醫院病理科的宋大萍老師給予病理技術支持與指導，感謝徐敬文、王小紅、吳思霖在動物實驗中給予支持與幫助。)