核糖體成熟因子RimP、Era和RimJ的研究進展

張樹軍，張國文，白 靚，曹瑞珍

（內蒙古民族大學 醫學院，內蒙古 通遼 028043）

核糖體是所有生物進行蛋白質合成的場所，無論是原核細胞還是真核細胞，核糖體的產生、組裝和成熟都是一個快速、復雜且能量消耗巨大的細胞過程，包括幾種rRNA和幾十種核糖體蛋白質的合成、加工、折疊、成熟和結合。它沿著多條平行途徑進行，并受到核糖體成熟（組裝）因子的引導，雖然已經研究多年，但核糖體成熟（組裝）因子在指導核糖體組裝和成熟中的作用機制仍然不是很清楚［1］。RimP、Era和RimJ是大腸桿菌核糖體30S小亞基的成熟因子，促進30S小亞基的組裝和成熟。此外，在細菌中一種蛋白質具有幾種功能是普遍現象，除了促進30S小亞基的組裝和成熟，RimP、Era和RimJ還對大腸桿菌的生長起著重要作用，RimP可影響翻譯過程的保真性，Era參與細胞周期調控和凋亡，RimJ參與細胞對環境信號的反應等。筆者總結了RimP、Era和RimJ在30S小亞基組裝和成熟過程中的作用以及它們的其他作用，為進一步揭示30S小亞基組裝和成熟的過程以及RimP、Era和RimJ的其他功能提供依據。

1 大腸桿菌核糖體的組成與功能

原核和真核生物的核糖體都是由大小兩個獨立的亞基組成的精密分子機器。原核生物大腸桿菌核糖體的沉降系數為70S，其中，小亞基為30S，大亞基為50S，小亞基和大亞基都是由核酸和蛋白質構成的復合物，蛋白質占總重量的1/3，核酸主要是rRNA。30S小亞基由1個16S rRNA（1 542個核苷酸）和21個蛋白質（S1-S21）構成；50S大亞基由5S（120個核苷酸）和23S（2 904個核苷酸）2個rRNA和33個蛋白質（L1-L33）構成，大小亞基構成的核糖體負責解析mRNA上的遺傳密碼，并將tRNA上的氨基酸依次連接成肽鏈。

2 大腸桿菌核糖體小亞基的組裝和成熟

大腸桿菌核糖體小亞基的組裝和成熟過程主要包括細胞內rRNA和核糖體蛋白的合成、加工和組裝?？煞譃樗姆矫妫海?）rRNA的轉錄、剪切以及堿基修飾。（2）核糖體蛋白的翻譯以及翻譯后修飾。（3）rRNA及核糖體蛋白的正確折疊。（4）核糖體蛋白與rRNA結合成為成熟的30S小亞基。

核糖體的組裝和成熟是由十幾種蛋白質指導的，包括伴侶（DnaK、RbfA、RimM）、GTPases（Era、Der、CgtE）、RNA重塑蛋白，如RNA解旋酶（DeaD、SrmB、DbpA）和RNA修飾酶，如甲基轉移酶（KsgA、RrmJ）等［2］。研究發現，細菌內核糖體小亞基的組裝是以16S rRNA的前體，即17S rRNA為初始物開始的，并且核糖體的組裝過程與rRNA的轉錄過程相偶聯，即在16S rRNA的轉錄合成還未完成時，核糖體的組裝已經開始，這樣可以加快核糖體的合成效率。所以，核糖體的組裝是從rRNA的5’端開始的。為了確保核糖體的組裝和成熟高效正確地進行，細胞內的一些蛋白有序地參與了核糖體的組裝過程，這些蛋白被稱為核糖體成熟（組裝）因子。盡管它們的具體分子作用尚不清，但這些核糖體成熟因子被認為通過引導核糖體蛋白與rRNA結合，并通過動力學效應來引導rRNA折疊，從而促進核糖體的組裝和成熟［2］。RimP、Era和RimJ是大腸桿菌核糖體30S小亞基的成熟因子，促進30S小亞基的組裝和成熟。

3 RimP的結構和功能

核糖體成熟因子P（RimP），以前稱為YhbC或P15a，基因長度為453 bp，編碼由150個氨基酸組成的分子量為16.7 kDa的蛋白，該蛋白由3個α螺旋和8個β折疊組成［4］。RimP促進核糖體組裝和成熟的作用最初是在rimP基因缺失突變體中發現的，在突變的細菌內，成熟且具有翻譯活性的70S核糖體的數量減少，而游離的30S和50S亞基積累增多。重要的是游離的30S亞基顯示出未成熟的特征，因為30S亞基中的rRNA是17S前體，而不是成熟的16S rRNA［5］。這些觀察結果表明，作為一種核糖體成熟因子，RimP的功能是促進30S小亞基的組裝和成熟。體外重構實驗進一步發現RimP可提高大多數核糖體蛋白與pre-30S小亞基（30S小亞基前體）的結合速率，尤其是與16S rRNA 5’端結合的核糖體蛋白S5和S12，它們的結合速度分別提高2倍和6倍，即RimP對S12與pre-30S小亞基結合的動力學效應最大，但是其他核糖體蛋白質與16S rRNA 5’端的結合動力學沒有改變，表明RimP的這些效應是特異的［4］。這兩種核糖體蛋白質都是最后結合到30S小亞基，由此推測RimP也在30S小亞基組裝和成熟的后期發揮作用。RimP促進S5和S12與30S亞基結合的作用也在體內得到了證實，從RimP缺失株分離出來的核糖體組裝中間物中缺少這兩種核糖體蛋白［6］。此外，還發現這些中間體的中心假結（與S5和S12結合的16S rRNA結構域）的形成受阻，推測作為30S亞基的后期裝配因子之一的RimP是通過穩定中心假結來促進與S5和S12的結合。研究表明，在大腸桿菌中，RimP與S5和S12直接相互作用，而在恥垢分枝桿菌中，通過免疫共沉淀和串聯親和純化發現RimP與S12存在相互作用，而與S5不存在相互作用［7-8］。

此外，RimP對細菌的生存和生長也很重要。研究發現大腸桿菌缺失rimP會導致生長缺陷，一個rimP缺失突變株（ΔrimP135）表現出溫度敏感的生長表型，在30℃、37℃和44℃時，其生長速度分別比野生型菌株降低1.2倍、1.5倍和2.5倍，表明隨著溫度的升高，生長速度顯著降低［5］。隨著溫度的升高，rimP缺失突變體中未成熟的16S rRNA、30S亞基和50S亞基也積累增多，而成熟的70S核糖體則減少，揭示rimP缺失突變體的生長缺陷是由核糖體組裝和成熟受阻所致。進一步的研究顯示，rimP缺失突變體的生長緩慢不能被其他已知的30S成熟因子如RbfA、RimM、Era、DnaK、YjeQ/RsgA或KsgA逆轉，表明RimP的這種作用是特異的。肺炎鏈球菌中RimP的同源蛋白SP14.3的缺失導致無法生存，偶發分枝桿菌的RimP對其在較低pH值的酸性體外條件下的生存至關重要，腸炎沙門氏菌的RimP對其毒力也起著至關重要的作用［9-11］。

但也有研究發現rimP的缺失導致細菌的生長速度加快，因為rimP的缺失可以提高其他的依賴NADPH的生物轉化活性，提高木糖醇的產生而加快生長速度［12］。

作為一種核糖體組裝的輔助因子，RimP還可能影響翻譯效率。RimP可能會引起密碼子的誤讀，降低翻譯的準確性。RimP的突變增強了MetK（S-腺苷甲硫氨酸合成酶）的表達和蛋白翻譯的準確性，從而增加了抗生素的產量［13］。

4 Era的結構與功能

核糖體成熟因子Era（E.coli ras-like protein），又稱為RbaA或SdgE，基因長度為906 bp，編碼一種類似Ras的GTP酶（GTPase），與核糖體30S小亞基相互作用，并促進30S小亞基的成熟［14］。刪除era的細胞提取物沒有翻譯活性，加入Era蛋白也不能恢復其翻譯活性［15］。Era是一種雙結構域蛋白，具有一個C端KH RNA結合域和一個N端GTPase結構域。KH結構域可識別16S rRNA的3’端反義SD（Shine-Dalgarno）序列附近的GAUCA核酸序列，并與之結合［16］。結合GTP的Era與pre-16S rRNA（16S rRNA前體）結合，改變pre-16S rRNA的構象，尤其是pre-16S rRNA頭區的h23和h24螺旋的折疊，以利于RNases對其進行加工，并提高其他核糖體成熟因子的活性，如KsgA。KsgA使pre-16S rRNA的h45中相鄰的兩個腺苷殘基甲基化［17-18］。16S rRNA的甲基化發生在其加工和成熟的后期，此時的30S小亞基還不具備翻譯能力，待16S rRNA成熟，Era通過水解GTP將其釋放。Era與pre-16S rRNA的結合可以阻止30S和50S亞基結合成為70S核糖體，提示Era是檢測16S rRNA是否成熟的重要蛋白［18］。金黃色葡萄球菌era的刪除導致成熟的30S小亞基數量明顯減少于50S大亞基，70S核糖體數量也減少，表明30S小亞基的成熟受阻［19］。體外組裝實驗還發現Era可以將核糖體蛋白S9、S11、S5和S12的結合速率提高2倍，3’結構域蛋白S7、S10、S13、S14和S19等的結合速率也出現不同程度的提高［18］。

Era是一種高度保守的蛋白質，在原核生物和真核生物中具有多種作用，除了參與核糖體組裝和成熟，還參與細胞周期調控和凋亡。Era是細菌細胞生存所必需的，通過耦合細胞生長速率和胞質分裂，在細胞周期調控中發揮重要作用。大腸桿菌的Era的表達受到抑制或Era的GTPase活性缺失，導致細胞周期中具有2個或4個類核的細胞分裂受阻。Era的完全刪除對細菌是致命的，缺失Era的大腸桿菌出現生長受阻，無法進行細胞分裂［20］。

Era通過其GTPase/GTP結合域在凋亡信號通路調控中發揮重要作用，Era GTPase結構域的氨基酸取代突變可誘導HeLa細胞凋亡，并且可以被Bcl-2阻斷。缺失C端的KH結構域，可以減輕Era突變體的凋亡，提示該結構域對Era功能的重要性［21］。

5 RimJ的結構與功能

核糖體成熟因子J（RimJ）基因是在1979年發現的位于大腸桿菌基因圖譜的23.7分鐘位置，長度為582 bp，編碼一種由194個氨基酸殘基組成的乙?；?，該酶特異地負責核糖體蛋白S5的Nα-乙?；?，促進核糖體30S小亞基的組裝和成熟。蛋白質的Nα-乙?；怯蒒α-乙?；福∟ATs）催化的，它將乙?；鶑囊阴］o酶A轉移到蛋白質N末端氨基酸殘基的α氨基上［22］。這種乙?；梢灾泻蚇端的正電荷，該效應也可能促進合成過程中多肽的正確折疊，還可能促進蛋白質與其他蛋白質或核酸的特異性結合和相互作用。Nα-乙?；钦婧松镏凶畛Ｒ姷牡鞍踪|修飾之一，發生在大約80%～90%的不同種類的蛋白上，大約50%發生在酵母中，但很少發生在原核生物或古生菌的蛋白上。細菌內蛋白的Nα-乙?；欠浅：币姷?，目前發現在大腸桿菌中只有4種蛋白質：核糖體蛋白L7、S5、S18和延伸因子EF-Tu發生Nα-乙?；?，它們分別被大腸桿菌的3種Nα-乙?；?，即RimL、RimJ和RimI乙?；?3］。研究發現在RimJ基因缺失的大腸桿菌中，核糖體蛋白S5未發生乙?；?4］。

RimJ既是核糖體蛋白的修飾酶，又是核糖體組裝因子［25］。研究發現在核糖體蛋白S5突變（G28D）的大腸桿菌中過表達rimJ時，會抑制與S5（G28D）相關的冷敏感，翻譯保真度下降和核糖體生成缺陷。如果將S5（G28D）突變與rimJ缺失結合，會增強S5（G28D）菌株的生長缺陷表型，而且rimJ抑制基因的功能是獨立于其乙酰轉移酶活性的［24］。還發現乙?；腟5與核糖體蛋白的結合速度比未乙?；腟5快，表明當S5與含16S rRNA的pre-30S亞基結合時，S5已經發生乙?；?6］。這種結合可以提高30S小亞基隨后的重塑或避免一些無效的置換，從而促進組裝過程。而且RimJ是在30S亞基成熟的中間階段與S5發生結合，表明S5的乙?；cRimJ的核糖體組裝功能可能發生在核糖體組裝的同一階段。

RimJ還參與細胞對環境信號的反應，環境信號在調節致病基因表達方面起著重要的作用，它可能影響病原體在宿主中的定植能力和在外部環境中的生存。研究發現rimJ的缺失緩解了尿路致病性大腸桿菌在低溫、營養豐富和葡萄糖環境下對菌毛基因papBA轉錄的抑制作用，但對fan、daa和fim操縱子的轉錄影響不大，表明RimJ在多種環境刺激下調節papBA的轉錄，并且是papBA轉錄的唯一負調控因子，此外，papI的轉錄也受到RimJ的調控［27］。

然而像許多rRNA修飾基因一樣，rimJ不是大腸桿菌生存的必要條件，而且非乙?；腟5同樣可以完成核糖體的組裝和成熟，這也說明核糖體蛋白的修飾可能有助于微調翻譯復合物的結構和功能。此外，rimJ缺失株的生存能力表明rimJ的核糖體組裝因子功能也不是必需的。表明大腸桿菌核糖體的組裝和成熟可能有多條途徑，當其中一條途徑受阻時，可以利用其他途徑完成核糖體的組裝和成熟，從而補償某些特定組裝因子的缺失，提高細胞生存的可能性［28］。

6 總結和展望

在大腸桿菌中，每個細菌中大約含有多達15 000多個核糖體，生長快速的細菌每分鐘可合成數千個核糖體［3］。說明細胞內核糖體的組裝和成熟不僅是一個復雜和耗能的過程，還是一個非?？焖俚倪^程，導致使用分離純化的方法來研究核糖體組裝和成熟的過程中有哪些成熟因子參與以及作用機制的難度很大。此外，核糖體的體外組裝需要特殊的溫度和條件，如高濃度的鹽、高濃度的鎂離子等條件；而且，與細胞內高效率的組裝相比，體外組裝效率卻很低，這也為通過體外組裝來研究核糖體組裝和成熟過程和機制帶來困難。不過，隨著研究方法和技術的發展，核糖體組裝和成熟的過程，以及在此過程中核糖體成熟因子的作用機制終將揭示出來。

研究核糖體成熟因子的另一個難題是它們的功能可能是冗余的，因為一些核糖體成熟因子基因的敲除只會導致細菌生長速率減慢，但并不致死，表明這些核糖體成熟因子的基因對細菌來說并不是必不可少的，雖然核糖體是細菌生長和繁殖不可缺少的，而且核糖體組裝和成熟過程還需要核糖體成熟因子參與。核糖體功能冗余的第二個體現是在某個核糖體成熟因子刪除或突變的菌株中過表達其他核糖體成熟因子可呈現補償效應，如Era突變的細菌中過表達KsgA可以恢復表型，RbfA的敲除菌株中過表達Era可以部分恢復其表型［18］。此外，除了與核糖體組裝和成熟過程相關外，核糖體成熟因子還有其他功能，所以并不能確定其必須性是否與其作為核糖體組裝因子的功能相關。不過，隨著研究的不斷深入，核糖體成熟因子的功能也終將揭示清楚。