小粒野生稻滲入系抗南方水稻黑條矮縮病QTL分析及利用

韋 宇， 李孝瓊， 陳 穎， 劉開強， 郭嗣斌*

(1.廣西壯族自治區農業科學院 水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室， 廣西 南寧 530007； 2.廣西壯族自治區農業科學院， 廣西 南寧 530007)

水稻病毒病是水稻三大病害之一，有水稻“癌癥”之稱，嚴重威脅著我國的糧食安全。與普通水稻黑條矮縮病不同，南方水稻黑條矮縮病是一種以白背飛虱為傳播媒介的水稻病毒病，其病原病毒為南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)，是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)第2組的一個新種[1]，該病于2001年在廣東省陽西縣晚稻田中首次被發現，在短短的幾年間病情蔓延迅猛，給我國南方廣大稻區及越南北部水稻生產造成了極大損失，甚至絕收[2]。目前，對南方水稻黑條矮縮病毒病的防治仍以防治飛虱為主，但長期施藥易使飛虱產生抗藥性，導致病害再次爆發[3-4]。實踐證明，發掘并利用新抗源培育抗病新品種是控制水稻病害最經濟有效和最環保的措施。挖掘南方水稻黑條矮縮病抗性資源、鑒定和定位抗性基因是當前我國南方稻區水稻抗病育種的當務之急。

國際上對由SRBSDV引起的南方水稻黑條矮縮病的研究主要集中在病毒檢測、分子生物學特點、發生危害及綜合治理等方面[2-11]，抗源鑒定與評價工作目前還處于起步階段，僅有幾篇關于抗性材料篩選的報道[12-15]。研究表明，生產上尚未普遍使用抗性品種來防治南方水稻黑條矮縮病病害，主要問題是抗性鑒定及品種培育存在技術困難，且耗時過長[16]。迄今為止，對南方水稻黑條矮縮病抗性的遺傳研究及抗性基因挖掘研究僅見零星報道[17-18]。農保選等[17-18]對419個廣西地方稻種資源核心種質的SRBSDV苗期抗性進行全基因組關聯分析，共檢測到8個抗病基因(R基因)，分別位于第1、第5及第11染色體上，可能參與SRBSDV苗期抗性的調控；利用來源于普通野生稻高抗SRBSDV的導入系D4為材料，將與水稻SRBSDV苗期抗性相關的主效QTL定位于第9染色體上102.3 kb處，將其命名為qSRBSDV9。

在前期研究中，廣西壯族自治區農業科學院水稻研究所利用1份抗南方水稻黑條矮縮病的小粒野生稻(Oryzaminuta)基因滲入系桂恢1561和高感病品種桂1025雜交構建F2為作圖群體，繪制了遺傳連鎖圖譜，并完成了重組自交系(Recombinant inbred lines, RILs)的構建。為南方水稻黑條矮縮病的抗性育種提供新的基因資源，筆者等對桂1025/桂恢1561的重組自交系群體進行南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定，對其抗性進行遺傳分析，并利用QTLNetwork-2.2軟件對RILs的南方水稻黑條矮縮病抗性 QTL 進行定位，旨在為南方水稻黑條矮縮病抗性育種提供基礎材料和理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

桂恢1561來自小粒野生稻基因滲入系，抗南方水稻黑條矮縮??；桂1025為三系雜交稻恢復系，高感南方水稻黑條矮縮病。2010年晚季廣西壯族自治區農業科學院水稻研究所以桂恢1561(抗病親本)為父本，以桂1025(感病親本)為母本，經雜交、自交，獲得F2遺傳分離群體，并構建了包含210份個體的重組自交系群體(F8)。重組自交系種植于專用病圃進行抗性鑒定，感病對照 Taichung Native (TN1) 由中國水稻研究所提供，廣西農業科學院水稻研究所繁殖和保存?？共φ罩姓銉?號，由浙江勿忘農種業股份有限公司生產。

1.2試驗方法

1.2.1南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定南方水稻黑條矮縮病是以白背飛虱為傳播媒介的水稻病毒病，其病原病毒為南方水稻黑條矮縮病毒。選擇廣西壯族自治區興安縣湘漓鎮麥源村的病圃(東經110°14′，北緯25°17′)為鑒定圃，該病圃位于我國白背飛虱遷飛的重要通道，雖然白背飛虱發生程度年度間有差異，但各年均有發生[20-21]。鑒定圃的白背飛虱量越大，其南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定越有效，鑒定效果越可靠?？剐澡b定參照于文娟等[15]的鑒定方法，于2016年4月26日播種感病對照品種TN1、抗性對照中浙優8號及210份重組自交系，秧田較常規管理增施尿素75 kg/hm2，苗期不使用殺蟲劑和殺菌劑。

6月6日移栽，將TN1(感病對照品種)作誘發南方水稻黑條矮縮病材料，TN1種植小區每行單本移栽6株(株距 15 cm、行距18 cm)。重組自交系穿插于TN1小區之間種植，每個重組自交系種植5行，每行10株(株距 15 cm、行距18 cm)，隨機區組排列，重復3次?？共φ罩姓銉?號每個重復種植1個小區，種植規格同重組自交系。大田管理較常規肥水管理增施尿素150 kg/hm2，除拔節初期用殺蟲雙防治1次稻縱卷葉螟外，其他生長期不使用殺蟲劑和殺菌劑。

移栽50 d后采用盤拍法調查對照及重組自交系材料的白背飛虱蟲量。在黃熟期，將明顯矮縮株和具高位分蘗的單株記為病株，調查各小區內50叢水稻的死亡株和存活的病株數。由于病圃內褐飛虱發生較重而引起部分植株枯死，為排除褐飛虱引起的枯死株影響，計算時以存活單株的矮縮株除以存活株總數計算南方水稻黑條矮縮病發病率。發病率= (存活病株數/存活株數) ×100%。以3個重復的發病率平均值作為重組自交系各株系的抗南方水稻黑條矮縮病表型值?？剐苑旨墭藴剩? 級，發病率0.1%～5.0%，高抗(HR)；2級，發病率5.1%～15.0%，中抗(MR)；3級，發病率15.1%～30.0%，中感(MS)；4級，發病率30.1%～50.0%，感(S)；5級，發病率>50.0%，高感(HS)。依照上述方法，2017年4月進行重復試驗，但由于當年自然災害的原因，導致試驗失敗，因此，2018年4月再次進行重復鑒定，獲得2年重組自交系對南方水稻黑條矮縮病的抗性表型數據。

1.2.2重組自交系基因型數據分析2015年9月至2016年12月，提取210份重組自交系材料的DNA，獲得其基因型。DNA提取、PCR反應、電泳和銀染檢測方法與前期研究相同[22]。選取在雙親間具有多態的202對均勻分布于水稻12條染色體上的SSR引物，對桂1025/桂恢1561的重組自交系210個株系材料進行全基因組標記分析，用JoinMap 4.0作遺傳連鎖圖。

1.2.3南方水稻黑條矮縮病抗性QTL分析結合重組自交系的表型數據和基因型數據，參照YANG等[22]的方法利用軟件QTLNetwork-2.2對RILs的南方水稻黑條矮縮病抗性進行QTL定位，分析各個抗性QTL的遺傳效應，預測最優的基因型值。

1.2.4對鑒定出的抗性較好的株系材料進行育種評價和利用選擇部分南方水稻黑條矮縮病抗性較好的株系材料作父本，分別與天豐A、豐田A和華浙2A等不育系配制雜交稻組合，對雜交組合進行試種和抗病鑒定，考查其配合力和抗病表現，評價其育種價值。同時利用抗病親本桂恢1561和部分重組自交系抗性株系為供體親本，以廣恢998、華占和桂恢553等優良恢復系為受體，進行回交轉育和分子標記輔助選擇，分離世代種植于廣西興安縣湘漓鎮麥源村的病圃進行自然誘發鑒定，選育新的抗南方黑條矮縮病育種材料。

2結果與分析

2.1南方黑條矮縮病鑒定結果的可靠性

由于南方水稻黑條矮縮病是以白背飛虱為傳播媒介的水稻病毒病，南方水稻黑條矮縮病鑒定區域白背飛虱量越大，其抗性鑒定越有效，鑒定效果越可靠。調查結果表明，2016年和2018年的水稻分蘗期感病對照TN1白背飛虱平均蟲量分別為35.2頭/株和43.6頭/株，白背飛虱蟲量充足，說明研究區域具備南方黑條矮縮病鑒定的外部條件。水稻黃熟期感病對照TN1各重復的病株率均為100%，抗病對照中浙優8號平均病株率小于5%，表現抗病，表明水稻南方黑條矮縮病田間發病充分，抗性鑒定結果可靠。

2.2重組自交系的抗性表現

對重組自交系各株系、抗性親本桂恢1561、感病親本桂1025的南方水稻黑條矮縮病調查結果表明，桂恢1561表現高抗，桂1025表現高感，210個重組自交系株系表現為偏正態連續性分布(圖1)，表明桂恢1561的南方水稻黑條矮縮病抗性可能受主基因和微效基因共同控制。根據南方水稻黑條矮縮病抗性分級標準，2016年和2018年從210份重組自交系中鑒定出抗及中抗的株系材料共計31份。

圖1 重組自交系南方水稻黑條矮縮病田間抗性頻次分布

Fig.1 Frequency distributions of the SRBSDV-resistance of RILs

2.3構建高密度遺傳圖譜

從圖2看出，桂1025/桂恢1561RILs構建的水稻遺傳連鎖圖中包括185個SSR標記，13個連鎖群，覆蓋了水稻全基因組1 202.5 cM的區域，標記平均間距6.5 cM。

圖2 桂1025/桂恢1561 RILs構建的水稻遺傳連鎖圖

2.4QTL的分析結果

從表1看出，2016年共檢測到4個抗病QTL，分布于第3、4、7和12號染色體上，表型貢獻率為6.5%～36.3%；其中效應值最大的QTL是qSRBSDV4，其位于第4染色體RM3471～RM518區間。來自桂恢1561的等位基因可降低病株率19.2%，表型貢獻率為36.3%，可能是主效基因。

2018年共檢測到3個抗病QTL，分布于第3、4和12號染色體上，表型貢獻率為8.7%～37.5%。其中效應值最大的QTL是qSRBSDV4，其位于第4染色體RM3471～RM518區間，來自桂恢1561的等位基因可降低病株率20.1%，表型貢獻率為37.5%，與2016年的結果較一致。因此，初步確定qSRBSDV4為抗南方水稻黑條矮縮病的主效QTL位點。

表1 2016年和2018年RILs抗南方水稻黑條矮縮病的QTL檢測結果

注：表中A為被檢測QTL的加性效應值，其負值表示抗性等位基因來自小粒野生稻。

Note: A is the additive effect value of QTL, and its negative value indicates that the resistance allele comes fromO.sativa.

2.5抗性株系材料的育種價值評價及利用

2017年早季從桂1025/桂恢1561的RILS中選擇14份抗南方水稻黑條矮縮病的株系材料作父本，分別與天豐A、豐田A和華浙2A等不育系配制42個雜交稻組合。對42個雜交組合于2017年晚季在南寧試種，考察產量性狀，并于2018年4月對42個雜交組合進行南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定。綜合抗性鑒定結果及考種結果，篩選得到7個配合力及抗性表現較好的株系材料(表4)，分別為GK1、GK3、GK5、GK6、GK7、GK11和GK13。

2015-2018年，以抗病親本桂恢1561和部分重組自交系抗性株系為供體親本，以廣恢998、華占和桂恢553等優良恢復系為受體，進行回交轉育和分子標記輔助選擇，分離世代種植于廣西興安縣湘漓鎮麥源村的病圃進行自然誘發鑒定，獲得BC2F3、F4和F5等各世代株系材料187份。2018年對187份株系材料進行抗性鑒定，篩選出農藝性狀基本穩定且對南方水稻黑條矮縮病抗性較好的株系材料32份。

表2 7個抗性材料所配部分雜交組合產量相關性狀表現

3結論與討論

研究從210份桂1025/桂恢1561的重組自交系株系中鑒定得到31份對南方水稻黑條矮縮病中抗以上材料，其中7份株系配合力較高；利用重組自交系定位到4個抗性QTL，qSRBSDV3位于第3染色體RM5548～RM85區間，qSRBSDV4位于第4染色體RM3471～RM518區間，qSRBSDV7位于第7染色體RM5508～RM1135區間，qSRBSDV12位于第12染色體RM7102～RM1261區間，其中qSRBSDV4為主效抗性位點。利用鑒定得到的抗性材料與部分恢復系材料進行雜交選育，獲得了一批抗性育種基礎材料。

野生稻長期在自然環境下生長，具有豐富的遺傳多樣性和對病蟲害的抗性，是寶貴的水稻病蟲害抗源。研究中重組自交系的親本之一桂恢1561來源于四倍體的小粒野生稻，其所蘊含的抗逆基因已在多項研究中得到證實[23-24]。近年來，南方水稻黑條矮縮病給水稻生產造成了巨大經濟損失，從小粒野生稻資源中發掘并利用新抗源培育抗性品種是防治該病的有效途徑之一。

病圃所在的廣西壯族自治區興安縣湘漓鎮麥源村，地處水稻飛虱自華南向長江流域遷移的“湘桂走廊”，歷年均有白背飛虱發生[25]，于文娟等[15]研究表明，該地區也可能是SRBSDV在我國重要的毒源積累和繁殖地。在興安病圃進行的田間自然傳毒鑒定法相對于人工接種鑒定法，避免了室內人工接種抗病性鑒定中用到的白背飛虱不易捕捉、不易大批量繁殖等缺點[12]，是一種簡便易行且經濟的鑒定方法。該病圃蟲量充足，發病充分，抗性鑒定結果可靠。

目前，部分學者僅開展了抗源鑒定與評價工作，雖獲得一些抗南方黑條矮縮病的材料[12-15]，但關于SRBSDV抗性相關的基因或QTL挖掘方面研究不多。農保選等[17]從廣西地方稻種資源核心種質中檢測到8個SRBSDV苗期抗性抗病基因，分別位于第1、第5及第11染色體上；農保選等[18]從普通野生稻導入系中定位到1個水稻SRBSDV苗期抗性相關的主效QTL，將其命名為qSRBSDV9，其位于第9染色體上102.3 kb處。研究發掘出的抗南方水稻黑條矮縮病的主效QTL位點qSRBSDV4位于第4條染色體上，與目前已報道的SRBSDV抗性QTL[17-18]不在同一條染色體上，因此認為qSRBSDV4是抗南方水稻黑條矮縮病的新位點，下一步將利用SLAF-seq技術和HighMap軟件對桂1025/桂恢1561的RIL開發高密度分子標簽，利用該高密度遺傳連鎖圖對主效QTL抗性位點qSRBSDV4進行精細定位，開發與目標基因緊密連鎖的標記，爭取實現基因的直接選擇和有效聚合，大幅縮短育種年限，提高育種效率。