制首烏含藥血清對人乳腺癌T-47D細胞增殖及ER表達的影響

朱璨 王嫣 李堯鋒 田敏 唐文超 楊長福 王和生

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）22-3062-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.08

摘 要 目的：研究制首烏含藥血清對人乳腺癌T-47D細胞增殖及雌激素受體（ER）表達的影響，探討其植物雌激素（PE）樣作用。方法：將性未成熟SD大鼠隨機分為空白組，戊酸雌二醇（Ev）組（陽性對照，0.12 mg/kg），制首烏低、高劑量組（0.75、3 g/kg，以生藥量計）以及制首烏低、高劑量+Ev聯用組（劑量同各藥單用組），每組10只?？瞻捉M大鼠灌胃等體積水，各給藥組大鼠灌胃相應藥物，早晚各1次，連續4 d。末次給藥2 h后采血，制備空白血清和含藥血清。將T-47D細胞隨機分為空白組，Ev組，制首烏低、高劑量組以及制首烏低、高劑量+Ev聯用組，分置于含20%空白或相應含藥血清的培養基中培養，采用CCK-8法檢測各組細胞的增殖率（PR），采用Western blotting法和逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表達情況。結果：與空白組比較，各給藥組細胞的PR[各給藥組（24 h），除制首烏高劑量+Ev聯用組外的其余各給藥組（48、72 h）]均顯著升高;且制首烏高劑量組（72 h）顯著高于Ev組，制首烏低劑量組+Ev聯用組（72 h）顯著高于同劑量制首烏單用組，而制首烏高劑量+Ev聯用組（72 h）顯著低于同劑量制首烏單用組（P<0.05或P<0.01）。Ev組、制首烏高劑量組和制首烏低劑量+Ev聯用組細胞中ER-α蛋白，各給藥組細胞中ER-α mRNA和ER-β蛋白以及Ev組、制首烏低劑量組和制首烏+Ev聯用組細胞中ER-β mRNA的相對表達量均顯著升高;Ev組細胞中ER-α蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著高于制首烏單用和聯用組;Ev組細胞中ER-β蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著低于制首烏低劑量+Ev聯用組，但ER-β mRNA的相對表達量顯著高于制首烏單用組和制首烏高劑量+Ev聯用組;制首烏低劑量+Ev聯用組細胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA以及制首烏高劑量+Ev聯用組細胞中ER-β mRNA的相對表達量均顯著高于同劑量制首烏單用組，而制首烏高劑量+Ev聯用組細胞中ER-α蛋白及其mRNA相對表達量均顯著低于同劑量制首烏單用組（P<0.05或P<0.01）。結論：制首烏含藥血清可促進人乳腺癌T-47D細胞的增殖，并可通過促進ER-α和ER-β蛋白及其mRNA的表達來發揮PE樣作用。但上述作用弱于雌激素，且兩者聯合可能會拮抗雌激素的作用。

關鍵詞 制首烏;含藥血清;T-47D細胞;細胞增殖;雌激素受體;植物雌激素樣作用

Effects of Processed Polygonum multiflorum Containing Serum on the Proliferation and the Expression of ER of Human Breast Cancer T-47D Cells

ZHU Can1，WANG Yan1，LI Yaofeng1，TIAN Min2，TANG Wenchao1，YANG Changfu1，WANG Hesheng1（1. College of Basic Medicine， Guizhou University of TCM， Guiyang 550025， China; 2. College of Pharmacy， Guizhou University of TCM， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of processed Polygonum multiflorum containing serum on the proliferation and the expression of estrogen receptor （ER） of human breast cancer T-47D cells， and to investigate its phytoestrogen （PE）-like effect. METHODS： Sexually immature SD rats were randomly divided into estradiol valerate （Ev） group （positive control， 0.12 mg/kg）， processed P. multiflorum low-dose and high-dose groups （0.75， 3 g/kg， by crude drug）， low-dose and high-dose processed P. multiflorum+Ev groups （same dose as single drug group）， with 10 rats in each group. Blank group was given constant volume of water intragastrically， and administration groups were given relevant medicine intragastrically; once day and night， for consecutive 4 days. Two hours after last administration， blank serum and containing serum were prepared. T-47D cells were also randomly divided into blank group， Ev group， low-dose and high-dose processed P. multiflorum groups， low-dose and high-dose processed P. multiflorum+Ev groups， and then were cultured in medium which contained 20% blank serum or drug containing serum. CCK-8 assay was used to detect proliferation rate （PR）. Western blotting assay and RT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression of ER-α and ER-β. RESULTS： Compared with blank group， PR of administration groups [each administration group （24 h）， other administration groups （48， 72 h） except for high-dose processed P. multiflorum+Ev group] were increased significantly; high-dose processed P. multiflorum group （72 h） was significantly higher than Ev group， and low-dose processed P. multiflorum+Ev group （72 h） was significantly higher than the same-dose processed P. multiflorum group; high-dose processed P. multiflorum+Ev group （72 h） was significantly lower than the same-dose processed P. multiflorum group （P<0.05 or P<0.01）. Relative protein expression of ER-α in Ev group， high-dose processed P. multiflorum group and low-dose processed P. multiflorum+Ev group， relative mRNA expression of ER-α and protein expression of ER-β in administration groups， relative mRNA expression of ER-β in Ev group， low-dose processed P. multiflorum group and processed P. multiflorum+Ev groups were all increased significantly. Relative protein and mRNA expression of ER-α in Ev group were significantly higher than processed P. multiflorum groups and combination groups. Relative protein and mRNA expression of ER-β in Ev group were significantly lower than low-dose processed P. multiflorum+Ev group， but relative mRNA expression of ER-β was significantly higher than processed P. multiflorum groups and high-dose processed P. multiflorum+Ev group. Relative protein and mRNA expression of ER-α and ER-β in low-dose processed P. multiflorum+Ev group as well as relative mRNA expression of ER-β in high-dose processed P. multiflorum+Ev group were significantly higher than the same-dose processed P. multiflorum group. Relative protein and mRNA expression of ER-α in high-dose processed P. multiflorum+Ev group were significantly lower than the same-dose processed P. multiflorum group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The processed P. multiflorum containing serum can promote the proliferation of human breast cancer T-47D cells， and play the PE-like role through promoting protein and mRNA expression of ER-α and ER-β. However， the above effects are weaker than estrogen， and the combination of the two may antagonize the effect of estrogen.

KEYWORDS ? Processed Polygonum multiflorum; Containing serum; T-47D cells; Cell proliferation; Estrogen receptor; Phytoestrogen-like effect

何首烏為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥塊根，其炮制品制首烏（Polygoni multiflori radix preparata）具有補肝腎、益精血、壯筋骨、烏須發之功效[1]?，F代藥理研究表明，制首烏具有植物雌激素（PE）樣作用，可抗衰老、抗骨質疏松，預防和延緩卵巢顆粒細胞凋亡，阻止卵泡閉鎖[2-3]。本課題組前期研究發現，制首烏可調節去卵巢大鼠的生殖軸，亦能抑制雷公藤多苷對大鼠生殖功能的破壞作用[4-5];同時在體研究表明，制首烏主要成分二苯乙烯苷能升高性未成熟小鼠的子宮系數，上調其子宮雌激素受體（ER-α、ER-β）的表達[6]。為進一步探討制首烏的PE樣活性及可能機制，本課題采用中藥血清藥理學實驗方法，以制首烏含藥血清為干預物，考察其對體外培養的雌激素受體陽性[ER（+）]人乳腺癌T-47D細胞增殖和ER-α、ER-β蛋白及其mRNA表達的影響，旨在為制首烏PE藥物研發以及臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BB15型CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Eclipse TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;Synergy 2型熒光/吸收光酶標儀（美國Bio-Tek公司）;Mini-Protean Tetra型電泳槽、C1000 Touch Thermal Cycler型聚合酶鏈反應（PCR）儀、ChemicDoc Touch型超高靈敏化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）;Nano Photometer-N80型超微量分光光度計（德國Implen公司）;Microfuge 20R型高速冷凍離心機（美國Beckman公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

制首烏飲片（四川省川源藥業有限公司，批號：171001）經貴陽中醫藥大學藥學院王世清教授鑒定為制首烏真品，各項質控指標均符合2015年版《中國藥典》（一部）的相關要求[1]。

戊酸雌二醇片（Ev，陽性對照，德國Jenapharm GmbH & Co. KG，規格：1 mg）;DMEM高糖培養基、DMEM高糖無酚紅培養基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）;胎牛血清（FBS）、活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清（CDT-FBS）（以色列Biological Industries公司）;青鏈霉素雙抗、CCK-8試劑盒（批號：013018181008）、細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒、QuickblockTM封閉液（上海碧云天生物技術公司）;兔源ER-α單克隆抗體、兔源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（內參）（美國CST公司，批號分別為6、4）;兔源ER-β多克隆抗體（美國Abcam公司，批號：GR3211677-6）;山羊抗兔IgG二抗（美國Jackson Immuno Research公司，批號：139799）;TRNzol Universal總RNA提取試劑盒、FastKing一步法逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒[含FastKing One Step RT-PCR Master Mix、RT-PCR Enzyme Mix、無RNA酶ddH2O等試劑，天根生化科技（北京）有限公司];PCR引物（序列見表1）由上海生工生物工程有限公司設計、合成;其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠60只，雌性，出生21 d（剛斷乳、性未成熟），體質量60～80 g，購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所，動物使用許可證號：SYXK（渝）2017-0003。

1.4 細胞

ER（+）人乳腺癌T-47D細胞由上海復祥生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 制首烏水煎液的制備

取制首烏飲片60 g，加5倍量（g/mL，下同）水浸泡30 min，煎煮至微沸，保持20 min，濾過;再加3倍量水，同法煎煮，濾過;合并兩次濾液，濃縮，制得每1 mL含生藥0.3 g的水煎液，經微孔濾膜濾過后，將濾液置于4 ℃保存，備用。

2.2 動物分組與給藥

參考文獻方法[7]，將大鼠隨機分為6組，即空白組，Ev組，制首烏低、高劑量組以及制首烏低、高劑量+Ev聯用組，每組10只?？瞻捉M大鼠灌胃等體積水，Ev組大鼠灌胃Ev 0.12 mg/kg（以水為溶劑，劑量根據人用臨床等效劑量換算而得），制首烏低、高劑量組大鼠分別灌胃“2.1”項下制首烏水煎液0.75、3 g/kg（以生藥量計，以水為溶劑，劑量參照人用等效劑量和本課題組前期預實驗結果設置），制首烏低、高劑量+Ev聯用組大鼠按上述單用劑量灌胃相應藥物;給藥體積均為1 mL/100 g，早晚各1次，連續4 d。

2.3 含藥血清的制備

末次給藥2 h后，麻醉各組大鼠，于腹主動脈取血，室溫靜置1 h，以2 000 r/min離心10 min，分離上層血清。合并同組大鼠血清，即得空白血清和含藥血清，于56 ℃下滅活補體30 min，經0.22 μm微孔濾膜濾過后，將濾液置于-20 ℃保存，備用。

2.4 細胞增殖情況檢測

采用CCK-8法檢測。將人乳腺癌T-47D細胞置于含10%FBS、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基中，于37 ℃、5%CO2、相對飽和濕度條件下培養（下同），于后續試驗開始前3 d，將培養基更換為含5%CDT-FBS、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖無酚紅培養基，以增加細胞對雌激素樣物質的敏感性[8]。取上述經預處理且處于對數生長期的T-47D細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗，經0.25%胰蛋白酶消化后，以3×103個/孔接種于96孔板中，每孔加入含5%CDT-FBS、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖無酚紅培養基150 μL，培養24 h待細胞貼壁后，將細胞隨機分為空白組、Ev組和制首烏低、高劑量組以及制首烏低、高劑量+Ev聯用組，每組設6個復孔。吸棄各孔上清液，空白組加入含1%青鏈霉素雙抗、20%空白血清（“2.3”項）的DMEM高糖無酚紅培養基150 μL，各給藥組分別加入含1%青鏈霉素雙抗、20%相應含藥血清（“2.3”項）的DMEM高糖無酚紅培養基150 μL，分別培養24、48、72 h，在各時間點分別加入CCK-8試劑15 μL，于37 ℃孵育2 h，使用熒光/吸收光酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A），并計算增殖率（PR），PR=（試驗組細胞平均A值/空白組細胞平均A值）×100%。上述試驗重復3次（下同）。

2.5 細胞中ER-α、ER-β蛋白表達情況檢測

采用Western blotting法檢測。取“2.4”項下經預處理且處于對數生長期的T-47D細胞，用PBS清洗，經0.25%胰蛋白酶消化后，以1×106個/孔接種于6孔板中，每孔加入含5%CDT-FBS、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖無酚紅培養基2 mL，培養24 h待細胞貼壁后，按“2.4”項下方法分組、給藥，每組設3個復孔。培養48 h后收集細胞，經細胞裂解液裂解后，吸取裂解液適量，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液，按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白定量。經5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液稀釋后，于100 ℃變性5 min。每組取變性蛋白20 μg進行SDS-PAGE電泳（電壓：120 V，時間：60 min），電泳結束后轉移至PVDF膜上，以封閉液室溫封閉15 min，加入相應一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;用TBST溶液清洗10 min×3次，隨后加入二抗（稀釋度均為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗10 min×3次，以ECL顯色后，采用超高靈敏化學發光成像系統成像并使用Image-Pro Express 5.1圖像處理軟件分析。以相應蛋白與內參β-actin條帶的灰度值比值作為目標蛋白的相對表達量。

2.6 細胞中ER-α、ER-β mRNA表達情況檢測

采用RT-PCR法檢測。取“2.4”項下經預處理且處于對數生長期的T-47D細胞，按“2.5”項下方法培養、分組、給藥，每組設3個復孔。培養48 h后收集細胞，采用TRNzol Universal總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，使用超微量分光光度計測定其純度（即A260 nm/A280 nm值，若A260 nm/A280 nm值為1.8～2.0即表明其純度符合要求[9]）。參照FastKing一步法RT-PCR試劑盒說明書進行RT-PCR，反應體系（50 ?L）：總RNA 2 ?L、2×FastKing One Step RT-PCR Master Mix 25 ?L，25×RT-PCR Enzyme Mix 2 ?L、上/下游引物各1.25 ?L、無RNA酶ddH2O 18.5 ?L。反應條件：42 ℃逆轉錄30 min，95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環35次;72 ℃再延伸5 min。擴增產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓：120 V，時間：45 min）后，采用超高靈敏化學發光成像系統成像并使用Image Lab 5.2.1軟件進行分析，以相應基因與內參β-actin條帶的灰度值比值作為目標基因mRNA的相對表達量。

2.7 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 制首烏含藥血清對T-47D細胞增殖的影響

作用24 h時，各給藥組細胞的PR均較空白組顯著升高（P<0.05）。作用48、72 h時，除制首烏高劑量+Ev聯用組外，其余各給藥組細胞的PR均較空白組顯著升高（P<0.05或P<0.01）;且在作用72 h時，制首烏高劑量組細胞的PR顯著高于Ev組，制首烏低劑量+Ev聯用組細胞的PR顯著高于同劑量制首烏單用組，而制首烏高劑量+Ev聯用組細胞的PR顯著低于同劑量制首烏單用組（P<0.05），詳見表2。

3.2 制首烏含藥血清對T-47D細胞中ER-α、ER-β蛋白表達的影響

與空白組比較，Ev組、制首烏高劑量組、制首烏低劑量+Ev聯用組細胞中ER-α蛋白以及各給藥組細胞中ER-β蛋白的相對表達量均顯著升高;且Ev組細胞中ER-α蛋白的相對表達量顯著高于制首烏單用及聯用組，而ER-β的相對表達量顯著低于制首烏低劑量組+Ev聯用組;制首烏低劑量+Ev聯用組細胞中ER-α、ER-β蛋白的相對表達量均顯著高于同劑量制首烏單用組，而制首烏高劑量+Ev聯用組ER-α蛋白的相對表達量顯著低于同劑量制首烏單用組（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表3。

3.3 制首烏含藥血清對T-47D細胞中ER-α、ER-β mRNA表達的影響

與空白組比較，各給藥組細胞中ER-α mRNA以及Ev組、制首烏低劑量組和制首烏+Ev聯用組細胞中ER-β mRNA的相對表達量均顯著升高，且制首烏單用及聯用組細胞中ER-α mRNA以及制首烏單用組、制首烏高劑量+Ev聯用組細胞中ER-β mRNA的相對表達量均顯著低于Ev組，而制首烏低劑量+Ev聯用組細胞中ER-β mRNA的相對表達量顯著高于Ev組;制首烏低劑量+Ev聯用組細胞中ER-α、ER-β mRNA以及制首烏高劑量+Ev聯用組細胞中ER-β mRNA的相對表達量均顯著高于同劑量制首烏單用組，而制首烏高劑量+Ev組ER-α mRNA的相對表達量顯著低于同劑量制首烏單用組（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表3。

4 討論

T47-D細胞是ER（+）人乳腺癌細胞株，富含ER，可受雌激素或雌激素樣活性物質誘導而增殖，是用以檢測雌激素樣活性的常用細胞株[10-11]。雌激素受體主要包括ER-α和ER-β兩種亞型，其中ER-α主要高表達于子宮、睪丸等組織，且總體活性高于ER-β[12-15]。

制首烏是傳統補益中藥，能補肝腎、益精血，本課題組前期研究發現制首烏及其活性成分在體內具有PE樣作用[6]?？紤]到制首烏成分復雜、須經血液循環分布和消化道吸收才能發揮相應作用[7]，故本研究采用中藥血清藥理學方法，制備制首烏含藥血清，并將其直接作用于T-47D細胞，初步探討制首烏的PE樣作用及可能機制。以含藥血清為干預藥物既可排除制首烏粗提物（如水煎劑）理化性質對體外研究的影響，也可真實反映藥物經在體消化、吸收和生物轉化后的藥效發揮過程[7]。與此同時，本研究還考察了制首烏與Ev聯用對細胞ER表達的影響，以進一步探討制首烏的雙重調節作用。

CCK-8試驗結果顯示，作用24 h時，各給藥組細胞的PR均較空白組顯著升高。作用48、72 h時，除制首烏高劑量+Ev聯用組外，其余各給藥組細胞的PR均較空白組顯著升高;且在作用72 h時，制首烏高劑量組細胞的PR顯著高于Ev組，制首烏低劑量+Ev聯用組細胞的PR顯著高于同劑量制首烏單用組，而制首烏高劑量+Ev聯用組細胞的PR顯著低于同劑量制首烏單用組。這提示Ev和制首烏均能明顯促進T-47D細胞的增殖。當單用制首烏時，這種促增殖作用有隨劑量增加而逐漸增強的趨勢，且在作用72 h時，高劑量制首烏的作用明顯強于陽性對照Ev;當制首烏與Ev聯用時，這種促增殖作用有隨劑量增加而逐漸減弱的趨勢，且在作用72 h時，低劑量聯用組的作用明顯強于低劑量單用組，而高劑量聯用組的作用則明顯弱于高劑量單用組，表明低劑量制首烏與Ev聯合具有協同作用，而高劑量制首烏與Ev聯合則具有拮抗作用。這可能與PE在體內的雙重調節作用有關，即當體內雌激素水平較低時，PE可與ER結合發揮雌激素樣作用;而當體內雌激素水平較高時，PE則可通過競爭性結合ER而產生抗雌激素作用[16]。但本研究并未考察Ev聯用劑量的影響，故上述結論有待進一步證實。

本研究結果顯示，Ev和制首烏均可不同程度地增加ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表達。其中，Ev組、制首烏高劑量組和制首烏低劑量+Ev聯用組細胞中ER-α蛋白，各給藥組細胞中ER-α mRNA和ER-β蛋白，Ev組、制首烏低劑量組以及制首烏+Ev聯用組細胞中ER-β mRNA的相對表達量均較空白組顯著升高;Ev組細胞中ER-α蛋白及其mRNA的相對表達量均顯著高于制首烏單用和聯用組;Ev組細胞中ER-β蛋白及其mRNA的相對表達量顯著低于制首烏低劑量+Ev聯用組，但其ER-β mRNA的相對表達量顯著高于制首烏單用組和制首烏高劑量+Ev聯用組。這提示Ev的促增殖作用較制首烏更強，與文獻報道的制首烏PE樣作用弱于雌激素這一觀點基本相符[16];同時，制首烏高劑量+Ev聯用雖能明顯上調T-47D細胞中ER-α mRNA的表達，但對ER-α蛋白表達的影響卻不明顯，可能與翻譯過程中轉錄因子的表達有關[17-18]，但具體機制尚需進一步探索。此外，制首烏低劑量+Ev聯用組細胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA以及制首烏高劑量+Ev聯用組ER-β mRNA的相對表達量均顯著高于同劑量制首烏單用組，而制首烏高劑量+Ev聯用組細胞中ER-α蛋白及其mRNA相對表達量均顯著低于同劑量制首烏單用組。這進一步揭示了不同劑量制首烏與Ev聯用促增殖作用的差異，即低劑量制首烏與Ev聯合后，對ER-α蛋白及其mRNA表達的上調具有協同作用;而高劑量制首烏與Ev聯合則呈拮抗作用。但與同劑量制首烏單用比較，不同劑量制首烏與Ev聯用均可促進ER-β mRNA的表達，但高劑量制首烏與Ev聯用對ER-β蛋白表達的影響則不明顯，這可能與設計ER-β mRNA引物序列時未包含變異片段、而高劑量制首烏單用能誘導引物序列某些片段的擴增有關[19-20]。

綜上所述，制首烏含藥血清可促進人乳腺癌T-47D細胞的增殖，并可通過促進雌激素受體ER-α和ER-β蛋白及其mRNA的表達來發揮PE樣作用。但上述作用弱于雌激素，且兩者聯合可能會拮抗雌激素的作用。此外，RT-PCR試驗結果提示制首烏PE樣作用的分子機制可能與Ev有所不同，故仍有待后續研究深入探討。

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