杠板歸提取物體外抗柯薩奇病毒B3作用機理初探

雷湘 周峰 陳科力 楊珍

【摘? 要】目的：本文旨在初步研究杠板歸提取物抗病毒作用的機理。方法：用不同處理方法得到的藥物樣品采用不同的作用方式作用柯薩奇病毒（CVB3）感染的Hep-2細胞，72h后MTT法測定細胞活性;利用體外培養的小鼠腹腔巨噬細胞，加入不同的藥物樣品，檢測巨噬細胞分泌的γ-干擾素量的變化，以此判斷杠板歸提取物對小鼠免疫功能的影響。結果：S2樣品具有直接殺死CVB3作用，還可以抑制CVB3病毒的生物合成并且具有明顯的刺激巨噬細胞產生γ-干擾素的作用;S1樣品具有一定的直接殺死CVB3作用，但其他作用機制不明顯。結論：杠板歸不同提取部位抗病毒效力不同，機理也不同。S2樣品可以直接殺死病毒，對于進入細胞內的病毒，可通過調節機體的免疫能力，抑制病毒在細胞內的生物合成來發揮抗病毒的效力;S1抗病毒作用不強。

【關鍵詞】杠板歸提取物;抗病毒作用;γ-干擾素;巨噬細胞;

【中圖分類號】R47????? 【文獻標識碼】A????? 【文章編號】1672-3783（2019）01-0082-02

杠板歸為一種蓼科一年生草本植物，主要有清熱止咳、散瘀解毒、止痛等作用，廣泛用于治療皰疹，潰瘍，瘧疾，水腫，濕疹，痢疾，百日咳，丹毒，毒蛇咬傷等，療效確切[2-3]。文獻顯示杠板歸具有較好的抗病毒的作用，但是其抗病毒作用的有效成分是什么，抗病毒機理是什么，亟待解決，我們選擇兩種不同的提取方法獲得的杠板歸提取部位作為實驗藥物樣品進行抗病毒研究，以期發現活性較高的有效部位?？扑_奇病毒在人群中感染十分普遍，與多種疾病都有關系，是病毒性心肌炎的主要病因，能引起心肌細胞的各種炎癥反應，影響心臟功能，目前國內外還沒有有效的治療CVB3藥物，我們前期預實驗發現杠板歸提取物具有一定的抗CVB3的作用，但作用有效成分和機理還未確定。本實驗為后期深入研究其抗病毒作用奠定了基礎。

1 材料

CO2恒溫細胞培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）;超凈工作臺（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）;XD-30倒置顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）;AG22331HAMBURG高速冷凍離心機（德國Eppendorf有限公司）;RPMI-1640（GIBCO公司）;小牛血清（GIBCO公司）;四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Amresco公司）;Hep-2細胞，由武漢大學基礎醫學院病毒研究所保存，細胞生長液為含10%小牛血清的RPMI-1640，細胞維持液為含2%小牛血清的RPMI-1640;CVB3（Nancy株），由武漢大學醫學院病毒所保存。病毒經Hep-2細胞活化增殖，細胞病變達75%以上時收獲，反復凍融3次，3000rpm離心30min，上清液分裝后-20℃保存備用。在Hep-2細胞上測定其TCID50為10-5。實驗中使用的感染劑量為100TCID50;IFN-γ試劑盒（QuantoBio 公司）;KM種小鼠，雄性，體重（20±2）g，購于湖北省疾病控制中心。

2 方法

2.1藥物樣品制備? 杠板歸提取物由湖北中醫學院中藥資源國家重點實驗室提供，樣品S1、S2分別為不同處理方法得到的不同提取部位的干燥粉末。具體提取方法如下：將杠板歸切小段，10倍體積水煮3次，合并水液，濃縮成相當于0.5～1g×ml-1原藥材的原液。用70%乙醇沉淀，取上清液回收乙醇，干燥，保存，作為S1樣品;上述扛板歸水提取醇沉淀后的沉淀干燥，保存作為S2樣品。

2.2藥物樣品對細胞的毒性測定? 96孔培養板上培養Hep-2細胞，使其生長成單層細胞后，棄去培養液，分別加入含有不同濃度藥物樣品的細胞維持液，使每組藥物終濃度分別為1、2、4、8、16、32mg·mL-1，37℃，5%CO2培養，每12h觀察一次細胞形態，并以正常細胞作對照，72h后MTT法檢測細胞活性，計算出藥物對細胞的TC50。每一藥物濃度均重復4孔。

2.3藥物樣品體外抗柯薩奇病毒試驗根據2.2藥物樣品對細胞毒性的實驗結果，在半數毒性濃度下確定高、中、低3個濃度梯度，以培養液對藥物樣品進行溶解和稀釋，分別用這三種不同濃度的藥物樣品對細胞進行處理。

2.3.1藥物樣品抗病毒吸附組 將含有不同濃度的藥物樣品的培養液0.1ml加入生長完好的單層Hep-2細胞96孔培養板中（每孔細胞數目大致相同），37℃，5%CO2孵育1.5h后，棄去含藥培養液，再加入0.1ml病毒液，37℃，5%CO2孵育1.5h后，棄去病毒液，再加入普通細胞維持液繼續培養。

2.3.2 藥物樣品對病毒直接作用組 將含有不同濃度的藥物樣品的培養液0.1ml和病毒液0.1ml混合，37℃，5%CO2孵育1.5h后，再加入到生長完好的單層Hep-2細胞96孔培養板中，37℃，5%CO2孵育1.5h后，棄去含藥含病毒培養液，再加入普通細胞維持液繼續培養。

2.3.3 藥物樣品抗病毒生物合成組 將0.1ml病毒液加入生長完好的單層Hep-2細胞96孔培養板中，37℃，5%CO2孵育1.5h后，棄去病毒液，再加入含有不同濃度的藥物樣品的維持液繼續培養。

以上三個實驗組經過處理后，37℃，5%CO2繼續培養72h～120h，參照正常細胞對照組，病毒對照組，每12h觀察細胞生長情況及相應CPE程度，72h～120h細胞對照組生長正常，病毒對照組出現75%以上典型CPE時采用MTT法檢測細胞活性。

2.3.4細胞活性測定和試驗數據處理 MTT法、細胞存活率和病毒抑制率的計算方法

MTT法測定藥物細胞毒性：96孔板棄去含藥維持液，每孔加入5%MTT溶液50ul，繼續培養4h，終止培養，棄去MTT液，每孔加入100ulDMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解，選擇570nm波長在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值。

細胞存活率= 藥物組平均OD值/細胞對照組平均OD值×100%;

病毒抑制率=（藥物組平均OD值-病毒對照組平均OD值）/（正常細胞對照組OD值-病毒對照組OD值）×100%;

半數細胞毒性濃度TC50為使藥物組OD值比正常細胞對照組降低50%的藥物濃度;

半數病毒抑制濃度IC50為保護50%的細胞免受病毒破壞的藥物組濃度。

用 SPSS 11. 5軟件來計算。采用治療指 數（TI） 作為評價指標來衡量藥物對病毒的抑制 效力。TI= TC50/IC50 。TI值越大，藥物抑制病毒的作用越強。

2.4小鼠腹腔巨噬細胞培養 3d前向小鼠腹腔內注入無菌的液體石蠟1ml，引頸處死小鼠，消毒后置于無菌操作臺內，剪開腹部，暴露出腹膜，用少許70%酒精輕擦腹膜壁后，注入5mlPBS液，然后用針頭輕輕挑起腹壁，吸出腹液置于離心管中，1000rpm4℃離心10min，去上清，加入含20%小牛血清的RPMI-1640培養液，37℃，5%CO2培養2h后，棄去培養液，然后加入20%培養液，37℃，5%CO2培養24h后消化細胞，離心去上清，用PBS洗兩次，將制備好的巨噬細胞懸液加入96孔培養板，并使每孔的細胞濃度控制在103ml-1中，37℃，5%CO2培養。

2.5將生長成單層巨噬細胞培養液棄去，分別加入含不同濃度藥物樣品的維持液，37℃、5%CO2培養，每12小時觀察一次細胞形態，并與正常細胞作對照，24h后MTT法檢測細胞活性，每一藥物劑量均重復2孔，計算TC50。

2.6 藥物樣品對小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響根據2.5的實驗結果，在藥物TC50范圍內，確定高、中、低3個濃度梯度，加入到生長成單層的巨噬細胞96孔板中，37℃，5%CO2培養，24h后，用γ-干擾素試劑盒檢測，在450nm處測定吸光度，根據公式釋放率%=（樣品OD值-陰性對照OD值）/陽性對照OD值×100%，計算得到藥物樣品的γ-干擾素釋放率（陽性對照和陰性對照均為試劑盒內含）。

3 結果

3.1藥物樣品對Hep-2細胞的毒性 不同濃度的藥物作用于Hep-2細胞72h后，用MTT法測定細胞活性。經過計算，得到S1樣品TC50為2.9μg×ml-1，S2樣品 TC50為3.4μg×ml-1。

3.2 藥物樣品抗CVB3病毒的作用

3.2.1藥物樣品抗病毒吸附組 兩種藥物樣品與Hep-2細胞事先作用1.5h再接種病毒后72h內，都沒有顯現出對感染CVB3的細胞具有保護作用，各孔細胞均出現典型的病毒病變，即CPE癥狀：細胞生長紊亂，細胞狀態發生變化，變圓或細長，顆粒增多，折光性增加，最后脫落死亡，說明CVB3在Hep-2細胞中的繁殖不受抑制，藥物樣品均無抗病毒吸附作用。

3.2.2 藥物樣品對病毒直接作用組 藥物和病毒直接作用后再感染Hep-2細胞，結果顯示S1、S2均有有一定的直接殺死作用。

3.2.3 藥物樣品抗病毒生物合成組 感染了CVB3病毒的Hep-2細胞藥物樣品進行處理，結果顯示S2具有比較好的抗病毒生物合成的作用，S1沒有該作用。

3.3藥物對小鼠腹腔巨噬細胞毒性實驗，不同濃度的藥物作用于小鼠巨噬細胞24h后，用MTT法測定細胞活性。經過計算，得到S1TC50為2.7μg×ml-1，S2 TC50為3.0μg×ml-1，

3.4藥物樣品對小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響，結果見圖2。

4 討論

本部分實驗通過柯薩奇病毒感染的Hep-2細胞為體外實驗細胞，發現三種不同提取方法獲得的不同杠板歸提取部位，對柯薩奇病毒具有不同的抗病毒效果，其中，S1樣品的直接殺死作用較強，達到了61.6%，S2抑制病毒生物合成的作用較強，達到了73.4%，而S3基本沒有作用。說明不同提取部位中所含成分不一樣，這對我們今后研究杠板歸藥物的抗病毒活性部位的篩選提供了實驗數據。

本實驗第一部分已經進行了體外抗病毒實驗，發現杠板歸提取物具有一定的抗病毒作用，特別是S2樣品，能顯著抑制病毒在細胞內的生物合成，但是作用機理還不能確定，激活免疫細胞，提高機體的免疫能力，就是非常重要的一種抗病毒途徑。

病毒感染機體以后，會激活機體的免疫系統產生應答，將病毒感染的細胞處理掉，機體免疫系統的激活，其實就是免疫細胞的激活，包括巨噬細胞、NK細胞，T細胞、B細胞等等。其中巨噬細胞起著非常重要的作用，他們吞噬病原體，激活T細胞，釋放各種細胞因子。IFN-γ就是巨噬細胞釋放的一種重要的細胞因子，發揮著重要的抗病毒作用。干擾素具有廣譜的抗病毒活性（它對乙肝病毒DNA及丙肝病毒RNA的復制有一定抑制作用）、抗腫瘤活性及免疫調節作用，可治療多種腫瘤病毒病，一般病毒病和若干腫瘤等疾病，并且在1982年，γ-干擾素已在E.COLI或者Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）中表達成功。[12]

本實驗第二部分，以小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象，利用藥物作用巨噬細胞一段時間后，測定巨噬細胞分泌的γ-干擾素的量是否有變化，以此來研究藥物的抗病毒機理。本文通過藥物影響巨噬細胞產生γ干擾素的模型，把杠板歸抗病毒機理進行了初探，對于對于研究杠板歸作用機理具有重要的意義。

參考文獻

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