食用油中苯并(a)芘的快速檢測研究

程 慧，黃 徽，周陶鴻，彭青枝

(湖北省食品質量安全監督檢驗研究院 湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，武漢 430070)

食用油中苯并(a)芘(BaP)的檢測方法目前主要是GB 5009.27—2016《食品安全國家標準 食品中苯并(a)芘的測定》中規定的液相色譜分析法。該方法檢測糧油和肉類食品中苯并(a)芘的含量適用于非現場檢測，不適用于現場的快速檢測[1-2]。食品快速檢驗方法可以在第一時間篩出有害物質且滿足市場監管的需求，其中較常用的方法有酶聯免疫法、膠體金試紙法、免疫層析法[3]。這3種方法應用于食品中風險物質的定量檢測難點基本上集中于抗體及人工抗原的獲得，人工抗原合成的關鍵在于載體蛋白是否與其偶聯，可通過酶聯免疫試劑盒檢測人工抗原的蛋白質含量，選擇最佳的人工抗原及其誘導機體免疫產生的抗體組合建立免疫傳感器[4-10]。免疫傳感器結合比色法是一種可以應用于市場監管中食品化學性污染物檢測的重要手段，其成功解決了如何將免疫識別轉化為快速且裸眼可見的難題，在食品中重金屬及農藥殘留等化學污染物殘留的快速檢測領域具有儀器價格低廉、檢測速度較快等優點。

傳統的免疫比色反應一般是基于酶標記物催化底物實現顯色反應，單純的酶標記抗體信號放大作用比較局限。一般的信號放大措施僅實施在標記抗體表面，而本試驗通過磁珠標記識別抗原磁珠標記的抗原與苯并(a)芘標準溶液競爭抗體后，再與酶標記抗體結合后進行顯色反應，苯并(a)芘標準溶液質量濃度越低，磁珠標記抗原結合的酶標記物顯色越深，最后加入終止液洗脫后檢測體系的吸光度可以間接反映苯并(a)芘標準溶液質量濃度。免疫磁珠的制備過程及其免疫分析原理見圖1。

圖1 免疫磁珠的制備過程及其免疫分析原理示意圖

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用小鼠由武漢華美生物工程有限公司提供，食用油樣品均為市場抽檢樣品。苯并(a)芘、苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲標準品，北京中科質檢生物技術有限公司；苯并(a)芘單克隆抗體、苯并(a)芘羊抗鼠二抗、苯并(a)芘包被抗原，武漢華美生物工程有限公司；羧基化磁珠(MB，粒徑1.0～2.0 μm，10 mg/mL)，購自美國Charm生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、4-嗎啡啉乙磺酸(MES)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、脲酶(Canavalia ensiformis，Type III)，購自美國Sigma-Aldrich公司；正己烷、二甲基亞砜、氫氧化鈉，購自國藥集團有限公司。

JN100-4恒溫混勻儀，UV-1901紫外-可見分光光度計，Waters e2695Alliance高效液相色譜儀，AB SCIEX 4500液相串聯質譜。

1.2 試驗方法

1.2.1 苯并(a)芘人工抗原及抗體的制備及篩選

根據文獻[3]提供的方法合成苯并(a)芘的人工抗原及單克隆抗體，將合成的H-BaP-BSA、H-BaP-KLH及H-BaP-OVA 3種免疫原免疫小鼠，免疫5次后選取效價及抑制率較高的試驗小鼠進行劑量加大的免疫試驗，提取小鼠的抗血清，純化后獲得相應單克隆抗體，利用間接競爭酶聯免疫法篩選出有效包被抗原和抗體的組合，通過單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對已經篩選出的抗體進行性能測試。同時，選取與苯并(a)芘分子結構類似的苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲同樣進行間接競爭酶聯免疫法，進一步測試該單克隆抗體的交叉反應率。

1.2.2 快速檢測苯并(a)芘顯色反應的構建

取4 μL(25 mg/mL)MB依照文獻[10-12]方法在其表面共價結合苯并(a)芘包被抗原(4 μg)及抗體(4 μg)，并將其重新分散在400 μL 50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖溶液中，4℃保存待用。將40 μL已處理的免疫磁珠分散液與100 μL不同質量濃度的苯并(a)芘標準溶液或樣品提取液在離心管中混合均勻，加入70 μL 50 mmol/L苯并(a)芘單克隆抗體，37℃渦旋混勻反應30 min，再加入酶標苯并(a)芘二抗[10]100 μL，37℃渦旋混勻反應30 min，所得混合液經磁分離后，采用100 μL pH 7.0 50 mmol/L PBST(吐溫體積分數為0.2%)和100 μL 50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl交替洗3次。最后向其中依次滴加100 μL 0.1 mol/L HCl和100 μL 50 mmol/L四甲基聯苯。充分混勻，靜置2 min后，將上清液于550 nm測定吸光度。

1.2.3 食用油樣品前處理

稱取10 g油樣于離心管中，加入5 mL 正己烷和15 mL二甲基亞砜并混合均勻。旋渦振蕩2 min，然后4 000 r/min離心2 min。棄去上層正己烷層。加入5 mL 正己烷，旋渦振蕩30 s，然后4 000 r/min離心30 s。棄去上層正己烷層。加入10 mL 氫氧化鈉溶液(2 mol/L)和15 mL正己烷，旋渦振蕩30 s，然后4 000 r/min離心30 s。吸取上層正己烷層于15 mL離心管，4 000 r/min離心2 min。取正己烷層于氮吹管中，50℃氮吹或空氣吹10 min，然后加入200 μL二甲基亞砜復溶，混合均勻，備用。

2 結果與分析

2.1 人工抗原的設計及分析

苯并(a)芘的分子結構中不含氨基、羧基、羥基等可與載體蛋白直接偶聯的基團，通過有機反應引入與載體蛋白結合的基團是目前合成人工抗原常用的方法，所得產物需核磁共振圖譜驗證，過程煩瑣。因為人工抗原的目的是刺激宿主產生相應抗體，其結合蛋白質的含量可間接驗證活潑基團的引入，由于在堿性環境下蛋白質分子中的肽鍵結構能與Cu2+絡合生成絡合物，同時將Cu2+還原成Cu+，而二喹啉甲酸試劑可特異地與蛋白質分子結合，形成有顏色的復合物，該復合物在562 nm處有高吸光度，其顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，可根據吸光度計算蛋白質的含量[7-8]。圖2為1.0 mg/L苯并(a)芘人工抗原和10 μg/L苯并(a)芘的紫外吸收光譜圖。

圖2 1.0 mg/L苯并(a)芘人工抗原(a)和10 μg/L苯并(a)芘(b)的紫外吸收光譜圖

由圖2可以看出，苯并(a)芘人工抗原相較于苯并(a)芘在550 nm處有明顯的特征吸收峰，表明苯并(a)芘人工抗原成功合成。

2.2 單克隆抗體的特異性

將H-BaP-BSA、H-BaP-KLH及H-BaP-OVA 3種人工抗原分別對小鼠進行免疫試驗，2個月后提取小鼠血清，利用間接酶聯免疫法測定抗血清的效價，結果見表1。

表1 人工抗原和抗體的間接酶聯免疫檢測結果

由表1可知，小鼠對3種人工抗原均產生了免疫反應，測得的血清效價符合常規要求，其中血清效價及抑制率最高的是H-BaP-OVA，故選擇該人工抗原作為試驗抗原及抗體的制備來源。

以H-BaP-OVA為包被抗原，采用該人工抗原刺激小鼠產生的抗體建立酶聯免疫檢測標準曲線，如圖3所示。

由圖3可以看出，當苯并(a)芘的質量濃度為0.05～10.00 mg/L時，抑制率與苯并(a)芘質量濃度的對數成良好的線性關系，R2=0.995 6。

通過間接競爭酶聯免疫對抗體的靈敏度及特異性進行測定，結果見表2。

由表2可知，H-BaP-OVA作為人工抗原篩選出的抗體可靈敏識別苯并(a)芘，其靈敏度為5.37 μg/L，抗體對苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲的交叉反應率很低，證明該抗體特異性較好。

圖3 苯并芘的酶聯免疫法檢測曲線

化合物半數抑制質量濃度/(μg/L)交叉反應率/%苯并(a)芘>5.37>100苯并蒽>1.23>1.19苯并熒蒽>1 000<0.01苯并苝>1 000<0.01菲>1 000<0.01

2.3 條件優化

為了確?；诿庖叽胖榈姆磻凶罴训拿复呋盘栟D導，在其他試驗條件一致的情況下(1.2.2試驗方法)，分別考察了抗體和辣根過氧化酶的用量，結果如圖4、圖5所示。

圖4 抗體用量對吸光度的影響

圖5 辣根過氧化酶用量對吸光度的影響

從圖4可以看出，在抗體用量低于4 μg時，100 ng/mL苯并(a)芘的信號響應隨著抗體用量的增加而不斷增大，直到抗體用量達到4 μg開始平緩。這說明抗體用量低于4 μg時，不能足夠識別抗原及酶標二抗，但是過多的抗體也會影響信號轉導。

從圖5可以看出，在高鹽溶液中100 μg辣根過氧化酶使納米探針的分散性更好，且產生較強的信號響應。因此，選擇4 μg苯并(a)芘抗體和100 μg辣根過氧化酶作為合成納米探針的最佳條件。

溫育時間是影響免疫分析性能的另一個重要因素。試驗研究了不同溫育時間下100 ng/mL BaP在免疫磁珠上的信號響應情況，結果見圖6。

圖6 溫育時間對吸光度的影響

從圖6可以看出，隨著免疫反應溫育時間的延長，響應信號不斷增大，直到溫育時間達到60 min后響應達到一個平臺。這說明該免疫磁珠溫育60 min時免疫反應可以達到飽和狀態，因此選擇60 min作為免疫反應分析的最佳溫育時間。

2.4 方法的線性回歸方程和檢測限

在最優試驗條件下，配制0.5 pg/mL～500 ng/mL 的苯并(a)芘標準溶液，采用1.2.2方法測定吸光度。結果表明，吸光度與苯并(a)芘質量濃度的對數呈較好的線性關系，線性回歸方程為：A=1.819 3-0.432 3lgC，相關系數為0.992，檢測限為0.12 ng/mL，定量限為0.5 μg/kg，比文獻[1,9,13]低得多。

2.5 方法的特異性

分別考察了2、5、10 ng/mL的苯并(a)芘、苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲標準品在該免疫磁珠上的信號響應，用免疫磁珠檢測，每個樣品重復3次，判斷免疫磁珠的特異性。結果見表3。

表3 苯并(a)芘、苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲標準品分別在免疫磁珠上的響應情況

從表3可以看出，與苯并(a)芘在該免疫磁珠上的靈敏信號響應相比，苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲在該免疫磁珠上沒有引起明顯的信號響應，說明非特異性多環芳烴在該免疫磁珠上引起的交叉反應較小。

2.6 方法的穩定性

在最優試驗條件下，用同批次和不同批次的免疫磁珠分別檢測1、10、100 ng/mL苯并(a)芘標準品，每個樣品重復測定5次，結果如表4所示。

表4 方法的穩定性試驗結果

由表4可知，該免疫磁珠具有較好的重復性和穩定性，RSD為3.4%～5.3%。

2.7 方法的加標回收率

在食用油樣品中添加一定量的苯并(a)芘標準品，使苯并(a)芘質量濃度為0.5、2、5、10 μg/kg，樣品經1.2.3、1.2.2方法處理。所選食用油樣品經液相色譜法確定為未檢出苯并(a)芘。經提取回收，將液相色譜、液質聯用、電化學傳感器法所得分析結果與免疫磁珠分析結果相比較(液相色譜條件為C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)、流動相為乙腈-水(88∶12)、流速1.0 mL/min、熒光檢測器激發波長384 nm、發射波長406 nm、柱溫35℃、進樣量20 μL)。液質聯用條件參考文獻[13]。電化學傳感器法參考文獻[14])。結果見表5。

表5 不同方法的加標回收試驗結果

由表5可知，本方法平均加標回收率為89.3%～100.1%，本方法的測定結果與其他3種方法測定結果相近，表明本方法用于實際樣品分析苯并(a)芘含量具有良好的可靠性和準確度。

3 結 論

本研究應用間接免疫法結合顯色反應快速檢測食用油中苯并(a)芘。通過在磁珠結合苯并(a)芘抗原，進一步連接抗體及酶標二抗，因辣根過氧化酶與四甲基聯苯發生的經典顯色反應，從而間接檢測苯并(a)芘含量。此方法的檢出限為0.12 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，加標回收率為89.3%～100.1%，方法具有良好的特異性和穩定性，可實現食用油中苯并(a)芘的快速檢測。