兩種檢測水貂阿留申病毒抗體方法敏感性的比較研究

王振軍，羅國良，易立，郭利，馮二凱，程世鵬，程悅寧

（中國農業科學院特產研究所，長春 130112）

水貂阿留申?。ˋleutian Mink Disease，AMD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease Virus，AMDV）引起的慢性、持續性傳染病，該病嚴重影響水貂的毛皮質量，損害其生育能力，降低存活率，是危害水貂養殖業的重要疫病[1-2]。該病目前仍沒有有效的疫苗來防控，檢測和淘汰阿留申病貂是目前主要防控該病的方法。自該病報道以來，國內、外研究人員建立了碘凝集、對流免疫電泳（CIEP）、PCR、間接免疫熒光、ELISA 等諸多診斷方法[3-7]，其中，對流免疫電泳法是目前國際公認的水貂阿留申病診斷的黃金法則，但該方法操作步驟繁瑣、耗時等缺陷，阻礙了AMD的檢測在基層的普及和推廣。

近年來，隨著科技進步及新型診斷技術的發展，對水貂阿留申病的診斷開啟了新的研究思路。水貂阿留申病的膠體金診斷法是近年新興的水貂阿留申病快速診斷方法[8-9]，其檢測簡便、快速、準確的優點收到基層用戶的廣泛好評。本研究對新開發的水貂阿留申病毒抗體膠體金快速診斷試紙與水貂阿留申病的金標準檢測法―對流免疫電泳法進行敏感性對比研究，以比較兩種檢測方法在檢測敏感性方面的差異。

1 材料

1.1 試紙條

水貂阿留申病毒抗體膠體金檢測試紙條由中國農業科學院特產研究所特種動物病原與免疫團隊制備。

1.2 血清來源及背景

1.2.1 質控血清 水貂阿留申病毒陽性質控血清10份，對流免疫電泳效價≥1∶8，由中國農業科學院特產研究所制備、保存和提供。

1.2.2 田間血清 自然感染田間血清100 份，由中國農業科學院特產研究所試驗動物基地采集，根據對流免疫電泳檢測結果，將自然感染血清分為弱陽性（對流免疫電泳效價＜ 1∶8）和陽性（對流免疫電泳效價≥1∶8）。

1.3 對流免疫電泳抗原

由中國農業科學院特產研究所特種動物病原與免疫團隊診斷制品實驗室制備、標定、檢測。

1.4 對流免疫電泳相關設備

高壓雙穩電泳儀 DYY-4C、臥式水平電泳槽DYCP-38C（北京六一儀器廠）。

2 試驗方法

2.1 血清稀釋

2.1.1 陽性質控血清 將10 份陽性質控血清ADVP1～ADVP10 樣品各1 份，用樣品稀釋液按不同比例進行稀釋，控制陽性質控血清對流免疫電泳（CIEP）效價1∶8～1∶16，取各個稀釋度的血清5μL 進行檢測。

2.1.2 弱陽性質控血清的制備 將10 份陽性質控血清用樣品稀釋液按不同比例進行稀釋，控制陽性質控血清對流免疫電泳（CIEP）效價1∶0.125～1∶8，制備檢測用弱陽性質控血清。

2.1.3 田間血清稀釋 將對流免疫電泳檢測確認的水貂阿留申病毒抗體效價田間血清倍比稀釋，取1∶8～1∶64 稀釋度進行試紙條檢測。

2.2 試紙條檢測與判定

取出適量的試紙條，取陽性質控血清、弱陽性質控血清、田間血清 5 μL 于加樣孔，然后滴加 80 μL 稀釋液（約3 滴），或直接滴加經稀釋的血清3 滴，10～15 min內讀取結果并記錄。

3 結果

3.1 陽性質控血清試驗結果

10 份陽性質控血清檢測結果均為陽性反應，陽性血清效價在1∶8～1∶16 時，試紙條對陽性血清的檢出率為100%，見表1。

表1 陽性質控血清檢測結果Table 1 Test results of positive quality control serum

3.2 弱陽性質控血清試驗結果

用試紙條檢測法和 CIEP 檢測法對10 份水貂阿留申病毒質控血清制備的不同稀釋度（1∶8～1∶64）弱陽性血清進行檢測，試紙條檢測法對電泳效價范圍在1∶8～1∶16 的血清1∶64 倍以下稀釋時，其陽性檢出率為100%，但隨著稀釋倍數的提高，試紙條質控線顯色呈下降趨勢；CIEP檢測法對稀釋度＜1∶32 的弱陽性樣品的檢測結果有較高的檢出率，但對稀釋度＞1∶64 的樣品檢測效率明顯下降。結果見表2、3。

表2 弱陽性質控血清試紙條檢測結果Table 2 Testing results of weak positive property controlled serum test strip

表3 弱陽性質控血清CIEP 檢測結果Table 3 Results of CIEP detection in weak-positive controlled serum

3.3 田間血清敏感性檢測結果

對流免疫電泳檢測確認的水貂阿留申病毒抗體效價100 份田間血清倍比稀釋后，對1∶8～1∶64 稀釋度進行試紙條和CIEP 檢測。結果顯示，1∶8 稀釋度下試紙條與CIEP 的陽性檢出率均為100%；1∶16 稀釋度下試紙條與CIEP 的陽性檢出率分別為100%、90%；1∶32 稀釋度下2 種方法的陽性檢出率分別為99%、55%，且試紙條多顯示弱陽性條帶，CIEP 法檢出率明顯下降；1∶64 稀釋度下檢測時試紙條陽性檢出率為96%，CIEP 法檢出率僅為23%。結果見表4。

表4 不同稀釋度田間血清樣品試紙條檢測結果Table 4 Testing results of field serum samples with different dilution

續表4

續表4

圖1 弱陽性質控血清試紙條檢測結果Fig.1 Testing results of weak positive property controlled serum test strip

4 討論

水貂阿留申病毒抗體膠體金檢測試紙條是用來定性檢測水貂阿留申病毒抗體的快速診斷產品，其檢測線（T線）的顯色深淺是隨水貂體內阿留申病毒抗體的含量而變化的，阿留申病毒抗體的含量高，則試紙條檢測線顯色深，用“++”表示顯色較深的陽性結果；阿留申病毒抗體的含量低，則試紙條檢測線顯色淺，“+”表示顯色較淺的弱陽性結果。

水貂阿留申病毒抗體膠體金檢測試紙條在對不同稀釋倍數的陽性質控血清進行檢測時，隨血清稀釋倍數的增加，試紙條檢測線有逐漸變淺的趨勢，說明隨著抗體的減少，試紙條檢測能力不斷下降；同樣的樣品用CIEP 法檢測結果顯示，樣品未做稀釋時，陽性質控血清檢出率為100%，當檢測經倍比稀釋的陽性質控血清所制備的弱陽性樣品時，CIEP的檢出率隨著稀釋倍數的增加而下降且產生的沉淀線也變得模糊、不易判讀。對田間樣品檢測結果再次驗證了上述事實，即CIEP法對檢測未經稀釋的樣品或稀釋倍數＜1∶16 時，其陽性檢出率和試紙條檢測法檢出率相當（檢出率≥90%）；當檢測樣品的稀釋倍數＞1∶16 時，CIEP的檢測效率明顯下降且檢測結果不易判定，不同檢測人員對結果的判讀容易出現較大誤差，而試紙條檢測法在檢測稀釋度＜1∶64 的樣品時，能保持較高的敏感性，其檢出率＞95%。

根據上述試驗中，用2 種檢測方法對水貂阿留申病陽性質控血清及田間血清進行了檢測，結果顯示，傳統的CIEP 檢測方法，在對未稀釋血清樣品檢測時，其陽性檢出率與試紙條檢測法的檢出率一致，但隨著樣品稀釋度的不斷增加，CIEP的檢測效率下降明顯且結果判定難度增加，判定誤差增加；試紙條檢測法在對稀釋度＜1∶64 的樣品檢測時仍有較高的檢出率。

目前，在世界主要水貂養殖國家，水貂阿留申病的檢測的通用方法依然是CIEP 法，在少數北歐國家，高通量ELISA 方法檢測水貂阿留申病也有較廣泛的應用，這些國家的水貂養殖集約化程度很高，市場成熟度方面我國與之相比還有較大差距；在我國特殊的養殖條件下，水貂阿留申病毒抗體膠體金檢測試紙條有其獨特的優勢，它使用靈活方便，操作簡便易行，結果準確可靠，對大范圍普檢、個體檢測均可靈活應用，對比CIEP 法其優勢明顯，未來有望替代CIEP 法成為檢測水貂阿留申病毒抗體的主流方法。