耳蝸毛細胞再生機制研究最新進展

韓賀舟 董耀東 魏薇 馬秀嵐

中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻咽喉頭頸外科

毛細胞是構成聽覺感受器的重要組成部分，研究表明，老化、噪聲及耳毒性藥物均可造成毛細胞損傷，進而導致感音神經性聽力損傷[1]。目前，國內外最新研究結果顯示，耳蝸毛細胞在魚和兩棲類動物中損傷后可以再生，但在哺乳動物中損傷后不可再生，故重建耳蝸感覺上皮結構，促進耳蝸毛細胞再生有望成為治療感音神經性聽力損失的理想手段[2]。大量研究表明，毛細胞再生可能與細胞自身修復，支持細胞和感覺上皮細胞的增殖和轉化，以及干細胞的轉化密切相關[3]。但毛細胞是否可以再生以及通過何種途徑實現再生尚存在爭議，故本文將從支持細胞的增殖和轉分化、誘導干細胞或者成熟體細胞向毛細胞系轉化及毛細胞的自我修復三個方面對毛細胞再生機制的最新研究進展進行歸納和總結。

1 支持細胞的增殖和轉分化

在哺乳動物胚胎發育過程中，耳蝸毛細胞和支持細胞有共同的前體細胞，因此支持細胞的增殖和轉分化是目前毛細胞再生研究的焦點。原代培養的橢圓囊感覺上皮細胞能產生毛細胞樣細胞，且能表達支持細胞的標記物，表明橢圓囊感覺上皮細胞可能是毛細胞再生的前體細胞之一[1]。

鳥類內耳再生實驗表明，毛細胞損傷后周圍的支持細胞大量增殖，而新生的毛細胞是通過有絲分裂增殖形成[2]，提示新生的毛細胞很有可能是周圍的支持細胞分化而來。目前，有研究者通過使用特殊的化學物質或者在小鼠的胚胎中轉染Atoh1基因，促進前庭系統中的支持細胞轉化為毛細胞[3]，進而緩解聽力損失。但結果顯示，這種基因治療具有很多致命的缺陷，首先Atoh1基因過表達會促進Mucin2的表達[4]，而Mucin2是許多粘液性癌的粘液性成分；其次Atoh1基因的過表達與髓母細胞瘤的發生相關。同時有實驗證明某種修飾過的Atoh1基因可加速腫瘤的生長速度[5-6]。因此，對于注入基因ATOH1治療聽力損失的安全性還有待考量。另外，細胞基因表達級聯與信號轉導被認為是決定毛細胞命運的最重要的臨床問題[7]。在毛細胞分化過程中，WNTs、FGFs、BMP、Shh和Notch等信號分子發揮了不同的作用。Notch信號和PCP信號在感覺上皮細胞和耳蝸器官會聚性伸展中的中心作用已被確定。Atoh1對于支持細胞分化的影響作用，除了Notch信號外，其他信號也參與了Atoh1的表達調控。例如，Sox2抑制Atoh1的表達并促進Prox1的表達，Prox1是針對新生支持細胞的轉錄因子[8]。在層狀上皮的基底細胞中，p63可維持基底細胞的增殖能力。p63在發育的耳蝸中表達，并誘導Atoh1、Prox1和Hes5的表達，調節聽覺上皮細胞的分化，并且p63基因的破壞導致Corti器官中額外的內/外毛細胞出現[9]。NMII集中在縮短的細胞-細胞連接處，是小鼠聽上皮會聚延伸所必需的[10]，但NMII在聽覺上皮細胞中的作用有待進一步研究確定。故有關耳蝸上皮分層、會聚延伸和前列腺上皮嵌合形成的特異性復雜性機制仍有待闡明。

miRNA因其具有高度保守性和其在細胞內的重要調節作用，是目前醫學領域研究熱點。其中，miRNA-183家族是位于人類7號染色體上的具有高度保守的miRNA家族的一員，有研究證明miRNA-183對于毛細胞再生有明顯的促進作用[11-12]。Notch信號通路通過下調miRNA-183的表達，抑制毛細胞的增殖，從而參與內耳發育和細胞分化的調控過程。同時也有實驗分別利用miRNA-182mimics和siRNA在新生大鼠耳蝸前體細胞中過表達和低表達miRNA-182，進而發現miRNA-182可以促進耳蝸前體細胞分化成毛細胞[13]。斑馬魚的毛細胞可以再生而小鼠作為哺乳動物的毛細胞一直以來被認為是不能再生的，分別對斑馬魚和小鼠的毛細胞進行研究，結果發現miRNA對于兩種動物模型的毛細胞調控作用一致，此項研究為聽力損傷的基因治療提供了可能性。通過支持細胞的增殖隨后產生毛細胞的有絲分裂再生，需要通過基因重編程過程，包括激活β—catenin以上調Wnt信號，缺失Notch1以下調Notch信號，以及新生小鼠耳蝸中的支持細胞Sox2(+)伴隨著過表達Atoh1。此外，在Notch1敲除的Sox2(+)細胞中，刪除β-catenin后，Notch1缺失誘導的毛細胞增殖消失，這進一步表明Notch信號是Wnt信號轉導的上游和負調控因子。通過與正常人耳蝸相比，β—catenin激活、Notch1缺失和β—catenin激活聯合Notch1缺失組的轉錄，鑒定了參與增殖和轉分化過程的多個基因，這些基因不是受單個信號傳導途徑控制，就是受Wnt和Notch聯合傳導信號的控制[14]。

2 誘導干細胞或者成熟體細胞向毛細胞系轉化

對于內耳的干細胞移植注射路徑主要有：圓窗、半規管、中階、蝸軸等，圓窗入路移植和半規管入路移植原理一致，都是通過外淋巴液的流動實現細胞遷移。因為圓窗注射途徑與臨床操作接近，所以在技術路線上可行性較高[15]。那么主要問題就在能否找到誘導干細胞向毛細胞轉化的小分子組合進而可以控制干細胞的信號轉導和表達[16]。但是干細胞治療存在許多局限性：首先是分化成功率比較低，轉化成功率僅有1%-2%[17]；其次是干細胞的分化潛能具有不可控性，容易導致腫瘤的產生，因為融合的細胞可能無限的分裂下去；并且移植的干細胞可能與宿主發生排斥反應；最后干細胞可能會向鄰近腦組織遷移進而破壞腦組織，因此干細胞治療感音神經性耳聾還面臨許多挑戰[18]。于是新的假想出現了：如果用分化成熟的人體細胞完成向毛細胞的轉分化是不是就能避免這些問題，有數據表明，基于GPA的治療能夠使成纖維細胞完成向毛細胞的轉化[19]。在成熟的耳蝸中，通過高分辨率的轉錄分離，將Isl1（胰島因子1）作為一種與Atoh1聯合重新編程的因素[20]，是目前比較前沿的轉化實驗研究。新霉素損傷可以顯著增加Lgr5+標記的祖細胞再生成毛細胞的能力，然而新霉素對于Lgr5+標記的祖細胞的增生效果不顯著[21]。目前關于Lgr5+祖細胞再生機制并不清楚，只能確定基因在細胞周期的調節中起到了重要作用。目前發現Cdkn1a、Mdm2、Tfdp1和 Wee1基因在 NLPs(neomycin-treated Lgr5+progenitors,新霉素處理Lgr5+祖細胞)中明顯上調，而Ccne2、Gadd45g、Nek2、Sfn和Stmn1在ULPs(untreated Lgr5+progenitors,未用新霉素處理的Lgr5+祖細胞)中明顯下調。其中Cdkn1a[22]和Mdm2[23]的機制得到了闡明。另外，轉錄因子也在Lgr5+標記的祖細胞再生中發生變化，在ULPs中，Hes1、Hes5[24]、Hey1[25]、HeyL[26]、Id1、Id2 和Id3[27]表達明顯下調。同時也發現miRNAs對于毛細胞的保護和再生有重要的意義，在NLPs中miR466i表達上調，而 miR7007、mmu-miR-703、miR107、miR361、miR6918、miR6982和miR3099表達下調[28]。Shh、Hippo和TGFβ三個信號通路對于內耳細胞的發育很重要[29-31]。

Sox2是控制毛細胞所必需的細胞因子，Sox2可通過激活Atoh1進而影響毛細胞的形成和成熟[32]。此外，Sox2單倍體不足和損傷是β—catenin誘導新生耳蝸的過渡細胞（從支持細胞向毛細胞樣細胞直接表型轉化的細胞）增殖和形成的允許信號[33]。研究表明，Sox2在分化毛細胞中的下調取決于Six1活性，Six1發生突變后可導致耳蝸中整個器官發育障礙[34]。在耳蝸器官分化過程中，維持Fgf8的表達及N-cadherin和E-cadherin的動態分布需要Six1[35]，且Six1基因劑量可能對內毛細胞和外毛細胞的發育有不同的影響。運動蛋白肌球蛋白II調節Corti器官的延伸以及毛細胞和支持細胞排列成有序的行。膠原受體DDR1與小鼠內耳非肌肉肌球蛋白IIA共定位，有助于運動細胞的構筑和穩定性。已經確定DDR1和NM-IIA共同定位在螺旋韌帶的III型纖維細胞（張力纖維細胞）、OHCs和內毛細胞的立體纖毛中，且DDR1與肌動蛋白/肌球蛋白復合物的蛋白質協同，以維持內耳的機械力，并穩定OHC細胞形狀，以便進行適當的聽覺信號傳導[36]，這是蛋白質組合療法的新思路。

3 毛細胞的自我修復

毛細胞的自我修復雖然在人類中沒有具體的研究，但是在蜥蜴的囊胚中，慶大霉素能夠誘導毛細胞損傷后的恢復與再生[37]，這表明，在外突和紋狀體出現感覺上皮修復和毛細胞再生，其中恢復主要通過支持細胞的增殖或者是毛細胞的自我修復實現。感覺上皮的細胞增生也是有限的，故毛細胞的自我修復是毛細胞再生的一個重要機制。胰島素、FGF2和EGF幾種營養因子的協同作用對毛細胞損傷丟失后的修復存在一定的影響。

4 小結

再生療法的當前策略是通過基因和藥物治療實現內耳毛細胞再生，替換受損的內耳細胞（細胞療法）。因此，目前可能尚無在活體內毛細胞再生的技術手段，但是對于耳蝸毛細胞再生和毛細胞修復的基因研究我們已經取得了突破，也許未來可以結合耳內鏡的探測技術和基因研究機制的突破，在耳蝸毛細胞再生研究領域將取得突破性進展。