聽覺毛細胞發育再生研究進展

易英 郝香月 涂鈺瑩 龍孝斌

感音神經性聽力下降可以由聽覺傳導通路中的耳蝸、聽神經、腦干聽覺通路和聽覺中樞病變引起，其中耳蝸毛細胞極其脆弱，易受藥源性、病原性以及噪聲暴露等諸多因素損傷?，F已有斑馬魚、鳥類和哺乳動物等多種脊椎動物模型被用于聽覺系統、造血系統、心血管系統和神經系統的研究[1]，斑馬魚因體型小、繁殖周期短、幼魚透明、產卵量大、與人類基因同源性高，被廣泛用于構建人類疾病模型和大規模的化學藥物和遺傳篩選[2, 3]。大量關于斑馬魚毛細胞再生的研究為哺乳動物毛細胞再生提供了潛在的靶點；因哺乳動物內耳毛細胞不能自發再生，目前研究主要圍繞著體外誘導前體細胞和干細胞分化為毛細胞。了解調控毛細胞發育的信號通路是毛細胞再生研究的另一方向；在斑馬魚、小鼠或禽類動物毛細胞發育及再生過程中，Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、Sonic hedgehog(Shh)信號通路、FGF信號通路等都起著關鍵作用，不同通路之間相互聯系、相互作用，共同組成調節毛細胞發育再生的信號網絡。本文從Wnt/β-catenin信號通路、Shh信號通路、Notch信號通路入手，綜述其在聽覺毛細胞再生過程中的研究進展，以初步了解多信號通路在毛細胞發育中的相互聯系。

1 毛細胞再生的發現

1987年，Cotanche在研究氨基糖苷類藥物誘導雛雞毛細胞死亡的過程中，偶然發現雛雞基底乳頭中感覺上皮再生的現象，打破了之前人們對脊椎動物毛細胞在有絲分裂后聽覺感覺上皮細胞受損后基本不能再生的認知[4]。1988年，Cotanche利用噪聲誘導雛雞毛細胞死亡后亦發現毛細胞再生的情況[5]，而后2003年Harris首次以新霉素處理致斑馬魚毛細胞損傷后，發現在一定濃度范圍內再生情況呈劑量反應相關性[6]。盡管鼠類基因與人類基因有99%的相似性，更適合用于研究哺乳動物毛細胞再生機制，但其繁殖周期長、成本高等缺點限制了小鼠模型的發展。近年來學者們對于體外誘導哺乳動物聽覺毛細胞再生的研究逐步深入，最初，Kawamoto等[7]利用腺病毒載體轉染Math1基因至豚鼠的耳蝸，在Cozti器、內溝細胞、Hensen細胞區域都發現了不成熟的毛細胞；隨后，編碼Atoh1的腺病毒轉染耳蝸感覺上皮并原位誘導毛細胞形成，Notch抑制劑DAPT和Atoh1的聯合應用增加了Atoh1表達水平并降低了hes1和hes5水平，進一步促進了體外毛細胞的產生[8]。小鼠體內研究發現新生小鼠毛細胞在注射白喉毒素誘導損傷后，支持細胞保持著有限的瞬時再生能力[9, 10]。

2 毛細胞再生的來源

在成年哺乳動物及人類內耳中，極少數前庭毛細胞可自發再生，而目前研究顯示耳蝸毛細胞損傷后是無法自發再生的[11]。與成熟哺乳動物耳蝸不同，新生的小鼠耳蝸毛細胞在損傷后具有短暫的自發再生能力[10]；而鳥類、斑馬魚和兩棲動物的相關研究已發現再生毛細胞來源。

2.1非哺乳動物毛細胞再生來源 雛雞支持細胞通過兩種不同的機制產生新的毛細胞：①支持細胞有絲分裂分化再生;②支持細胞的直接轉分化，即一種細胞改變其表型而獲得另一種分化狀態，但這一過程不進入細胞周期[12]。斑馬魚作為另一種非哺乳動物模型，其側線神經丘毛細胞與內耳毛細胞同源，影響側線神經丘毛細胞功能的突變也會導致人類耳聾。側線神經丘是由處在中央區的感覺毛細胞、位于毛細胞下方的支持細胞和環形包繞神經丘的蓋細胞共同組成的。Romero-Carvajal通過70小時延時記錄跟蹤側線毛細胞譜系，發現在新霉素處理后，支持細胞的轉分化是側線毛細胞再生的主要途徑，其次少數支持細胞通過有絲分裂增殖分化為毛細胞，極少數情況下藥物嚴重損傷神經丘導致支持細胞耗竭，蓋細胞才能進入細胞周期轉分化為毛細胞[13]。

2.2哺乳動物毛細胞再生的可能來源 毛細胞極易受到感染、噪聲和藥物(如：鉑類[14,15]、氨基糖苷類藥物、銅)等因素的損害[4]。目前體外研究中哺乳動物毛細胞再生的可能來源如下：①前體細胞(存在于耳蝸內，在分化階段上處于毛細胞上游，并能夠進一步分化成毛細胞的細胞):Wnt信號通路的靶基因Lgr5標記的耳蝸支持細胞在體外和體內均表現為感覺前體細胞，而這些細胞具有再生毛細胞的內在能力[16]。②支持細胞：新生小鼠支持細胞保持著有限的瞬時再生能力，且能夠下調細胞周期抑制劑，重新進入細胞周期并在體外培養中產生毛細胞[9]。White等[17]從新生小鼠耳蝸中分離的支持細胞可在體外增殖，并具有轉分化為毛細胞的潛能，但這種增殖能力在小鼠出生后的第2周停止。③小上皮嵴細胞：Zhai等[18]從大鼠小上皮嵴分離得到前體細胞,當誘導表達Hathl基因時，這些前體細胞表現出毛細胞樣細胞的特征，將這些細胞與間充質細胞共培養能產生具有毛細胞特異標記的細胞。④干細胞：干細胞因強大的自我更新能力和多向分化潛能等優點，為哺乳動物毛細胞再生提供了一個更具前景的方向。胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)、誘導多能性干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)、內耳干細胞(inner stem cell,IESC)以及外源性成體干細胞(嗅覺上皮細胞、毛囊干細胞、間充質干細胞等)都具有分化為毛細胞的潛能[19]。雖然眾多研究顯示干細胞能在體外誘導分化為毛細胞，但移植的方式、移植細胞的分化階段、新生毛細胞的功能和特性以及移植后的穩定性、安全性等都還需要進一步的研究，而其中最為關鍵是需要恰當地調控再生毛細胞的數量及其定位，以期發揮毛細胞正常功能。

3 毛細胞再生關鍵調控因子及相關途徑

目前研究顯示毛細胞再生是多靶點多基因調控的過程，其中以Wnt/β-catenin信號通路和Notch信號通路的研究最為深入；此外還有Shh信號通路、FGF信號通路、JAK-STAT等，各個通路之間有聯系亦有區別[20, 21]。相關的調控因子也有很多，如：Shh、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、轉錄激活因子3(stat3)、維甲酸(retinoic acid,RA)、組蛋白H3K9二甲基化( dimethylation of lysine 9 on histone H3,H3K9me2)、microRNA 183家族[22～26]等。

3.1Wnt/β-catenin信號通路 Wnt信號通路在細胞發育、生長和再生過程中起重要作用，目前可以分為以下三類，經典Wnt/β-catenin 信號通路、Wnt/PCP信號通路以及Wnt/calcium信號通路，其中經典Wnt/β-catenin 信號通路研究較為成熟。Wnt是一組富含半胱氨酸的分泌性蛋白,廣泛存在于各種動物及各種組織中。由于Wnt信號與受體Frzzled結合，引發低密度脂蛋白相關受體蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)被糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase,GSK3)和其他激酶磷酸化，從而使Axin與LRP結合，致使Axin/APC/GSK3/β-catenin復合物解離，避免β-catenin被GSK3磷酸化從而轉位至細胞核內與TCF結合，激活靶基因轉錄[27]。

研究報道Wnt/β-catenin不僅在斑馬魚后側線細胞遷移起重要作用[28]，并且參與哺乳動物內耳早期的聽基板及聽泡的分化[29]。Head等[30]研究發現斑馬魚神經丘在穩態或氨基糖苷類損傷后，GSK3β抑制劑(1-azakenpaullone)刺激Wnt信號通路引起支持細胞增殖顯著增加；另一方面過表達dkk1b抑制Wnt信號傳導可抑制毛細胞發育和再生過程。此外，Wnt信號可與dkk2形成負調控循環，維持神經丘形態及大小[31]；而在電離輻射處理后的斑馬魚可通過釋放dkk2抑制Wnt信號通路，同時抑制支持細胞的活性導致毛細胞再生障礙[32]；這些研究表明，Wnt信號通路對調控毛細胞發育、生長和再生過程中支持細胞增殖起重要作用。Jiang等[33]在新霉素導致斑馬魚毛細胞死亡后1、3和5 h對神經丘進行表達分析，發現Notch和Fgf信號在再生的最初幾個小時內被下調，而Wnt信號在再生的前10個小時內沒有被激活，說明Wnt沒有參與觸發毛細胞增殖的初始階段?？偠灾?，雖然Wnt通路明顯影響再生毛細胞的數量，但卻不觸發再生。

盡管許多研究已經明確了經典Wnt信號通路在哺乳動物耳蝸毛細胞發育過程中的作用，但其在哺乳動物毛細胞再生中的具體作用有待進一步研究。Li等[34]發現抑制Notch信號通路可誘導新生小鼠耳蝸支持細胞中β-catenin的過表達和Wnt下游靶基因的激活，表現為Lgr5+支持細胞增殖并促使它們向毛細胞轉分化。富含亮氨酸G蛋白偶聯受體5(leucinerich repeat-contianing G protein-coupled receptor 5,Lgr5)是近年來發現的Wnt信號通路的靶基因，是G蛋白偶聯受體家族中的成員之一。Lgr5+支持細胞在體內和體外通常都處于靜止狀態，但當它們分離為單個細胞時將具有增殖和轉化為毛細胞樣細胞的能力。Shh信號傳導的激活亦促進Lgr5+祖細胞的增殖和隨后的毛細胞分化[21]。此外，Lgr5+支持細胞過表達β-catenin和Atoh1，可增加Lgr5+支持細胞增殖分化為毛細胞，但新生的毛細胞仍為不完全成熟的毛細胞[35]，卻為研究哺乳動物毛細胞再生提供了可行的新方向。最近一項研究[36]發現Wnt和Notch信號通路在Lgr5+祖細胞和Lgr6+祖細胞中基因表達水平相似，與Lgr5+祖細胞相比，Lgr6+祖細胞具有更強大的分化為毛細胞的能力，而Lgr5+祖細胞比Lgr6+祖細胞具有更強的增殖能力。

3.2Shh信號通路 Shh是Hedgehog(Hh)基因家族中的一類，也是目前研究廣泛的信號通路之一。Shh信號通路在胚胎發育過程中參與調控多個器官及組織的生長發育。分泌性配體Shh結合其受體Ptch，減弱了Ptch對Smo的抑制作用，Smo膜蛋白去阻遏，激活Gli轉錄因子,觸發胞內信號轉導機制，啟動下游靶基因轉錄[37]。

研究發現Shh信號與內耳結構的形態發育關系十分密切[21],特別在背腹軸(dorsoventral axis，D-V 軸)的形成中起到關鍵性作用。Shh信號通路轉錄因子Gli3R和Gli2/3A之間的平衡調控著哺乳動物內耳D-V 軸的長度[38]。Shh濃度影響著內耳原基的發育分化方向，內耳原基中Shh濃度高的部位發育成腹側的聽覺器官，Shh濃度低的部分發育成前庭器官。亦有研究發現,Shh通過調節cAMP依賴性蛋白激酶A(PKA)的濃度，從而抑制Gli3活性，影響小鼠內耳發育中的腹側極性[39]；在沒有新霉素處理的情況下，Shh信號通路上調并沒有顯著促進細胞增殖或新的毛細胞形成，然而，在新霉素損傷感覺上皮后，過度激活Shh信號導致新生小鼠耳蝸上皮外植體中支持細胞增殖和毛細胞再生,并提出Fgf、Wnt、Notch和Hedgehog信號通路之間復雜的相互作用促進毛細胞再生，Mfng基因可能是Hedgehog信號通路的下游靶標，并可能作為耳蝸感覺上皮細胞中Hedgehog和Notch信號通路之間的介質[21]。雖然現已有很多研究分析了Shh作用于耳蝸發育期間的信號傳導，但其在毛細胞再生過程中的作用有待進一步研究。

3.3Notch信號通路 Notch信號通路是一種進化上保守的通路，可以抑制各種組織中的細胞模式：如增殖、分化和凋亡。哺乳動物具有4種不同類型的Notch受體(Notch 1～4)和5種Notch配體(Jagged 1、Jagged 2和Deltal、Delta3、Delta4 )，Notch受體由胞外區(N-terminal extracellular do main，NEC)、跨膜區(transmembrane domain，TM) 和胞內區((Notch intracellular domain，NICD)3部分組成。當相鄰細胞表面的Delta或Jagged配體與Notch受體結合后，Notch受體蛋白水解，釋放NICD，然后轉位到細胞核中與DNA結合蛋白CSL結合并形成活性轉錄復合物，隨后MAML轉錄激活蛋白家族與該復合物結合，從而誘導了Notch靶向基因的轉錄[40]。

在小鼠內耳發育過程中，Notch信號通路使胚胎前體感覺細胞定向分化成毛細胞，同時形成支持細胞，亦通過側抑制發揮作用，使新生的毛細胞中抑制Atohl和其他促進毛細胞分化的基因表達。Atoh1在耳蝸上皮細胞中過度表達可誘導新的毛細胞形成，腺病毒介導的Atoh1過度表達主要使用在大鼠小上皮嵴并誘導異位毛細胞再生，但轉導率低[8]。但Notch抑制劑DAPT和Atoh1的聯合應用增加了Atoh1表達水平并降低了hes1和hes5水平，促進體外大鼠耳蝸感覺上皮細胞毛細胞再生[8]。Walters等[20]提出GATA3或POU4F3和ATOH1的共活化促進成年小鼠中SCs向HC的轉化，遺憾的是，雖然GATA3或POU4F3的異位表達能夠克服Atoh1介導的SC轉化的年齡限制，但轉化的細胞仍然不成熟。

4 聽覺毛細胞發育和再生過程中信號通路之間的相互作用

Notch和Wnt信號傳導是耳蝸發育期間的前體細胞增殖和細胞再生過程中必不可少的信號通路。調節任一途徑中的信號傳導是毛細胞再生的潛在的研究方向。隨著研究深入，最近發現Notch和Wnt信號在毛細胞發育和再生中有相互調控作用[13, 34]。抑制小鼠毛細胞有絲分裂時Notch傳導，Wnt信號在Lgr5+支持細胞中被激活并促進它們進入細胞周期并分化成毛細胞，表明Notch信號傳導對毛細胞祖細胞中的Wnt信號傳導活性發揮起抑制作用；因此，通過干擾Notch和Wnt信號傳導之間的相互作用來靶向兩種途徑提供了毛細胞有絲分裂發生的潛在方法。支持細胞中的Notch抑制和Wnt活化同時顯著促進前庭毛細胞的有絲分裂生成，這比單獨調節信號傳導更有效[41]。

在小鼠內耳發育過程中，Shh通路與Wnt通路相互拮抗，同時Notch、FGF、BMP等多條信號通路形成了復雜的信號網絡系統，共同調控和維持內耳發育。尤其在小鼠內耳D-V 軸的形成中Shh通路與Wnt通路起著決定性的作用，Wnt的靶基因主要位于背側，Shh的靶基因主要位于腹側，這也是耳蝸與前庭系統、聽覺系統形成差異的關鍵因素，Shh通路與Wnt通路相互拮抗維持內耳形態發育的平衡，Shh信號通路通過抑制Dlx5/6，從而降低耳蝸背側Wnt信號通路的活性；此外在缺乏后腦的內耳外植體中，腹側Shh靶基因Pax2和Ngn1的表達沿著耳蝸的側壁異位擴展，說明Wnt信號對腹側Shh信號的表達有抑制作用[42]。

Shh信號通路、FGF信號通路和Notch信號傳導靶基因相互作用以調控聽覺毛細胞分化模式。在耳蝸前體細胞中，Shh信號通路通過維持Notch效應分子Hey1和Hey2的表達水平，負調節Atoh1表達以防止毛細胞過早分化，此外，Shh信號傳導對Hey1和Hey2的正調節很可能是由FGF信號介導；因此，Shh信號-FGF信號-Notch效應物Hey1和Hey2-Atoh1可能是誘導毛細胞的潛在靶標[43]。通過中斷這些信號傳導途徑之間的相互作用，抑制Shh信號傳導和/或其下游途徑與Atoh1過表達結合以刺激聽覺毛細胞再生可能是可行的；然而，目前尚未研究該策略的有效性，并且需要進一步研究這些信號傳導途徑在損傷后毛細胞再生中的相互作用。

5 展望

Wnt、Notch、Shh信號通路在調控內耳發育、支持細胞和毛細胞增殖再生過程中起到不可或缺的作用，在可再生生物模型或哺乳動物模型中，通過控制耳蝸發育期間的前體細胞增殖和細胞再生過程中的信號通路，將是毛細胞再生的潛在研究方向。因此，深入了解毛細胞發育的細胞環境以及這些關鍵調節因子之間的相互關聯對于研發治療感音神經性聽力損失的新策略將具有重要意義。