中藥三七防治腎纖維化的研究進展

李 娜，王風云，高小玲，全宏勛，賀 生，劉安麗

（1.鄭州澍青醫學高等?？茖W?；A醫學部，河南鄭州 450000；2.河南應用技術職業學院護理學院，河南鄭州 450000；3.河南中醫藥大學，河南鄭州 450000）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）是指各種原因引起的慢性腎臟結構和功能異常。據統計慢性腎病患病率為8%～16%,慢性腎臟病已被評估影響超過10%的西方人口［1］。慢性腎病因為發病率和死亡率高,目前已經成為影響全球性的公共健康問題。腎纖維化是CKD的共同特征,表現在腎小球和間質區細胞外基質 （extracellular matrix,ECM）蛋白的異常和過度沉積。腎纖維化是慢性腎臟病進展的標志,且慢性腎臟病的嚴重程度通常與腎纖維化程度相關［2］。但慢性腎臟病在臨床環境中的治療選擇很少且通常無效,特別針對腎纖維化的批準治療幾乎不存在。無論是治療還是預防這種疾病,都必須從阻斷或者延緩腎臟纖維化進程開始。

基于中醫藥三七長期的臨床治療經驗及其獨特的優勢,近20年來研究者從三七單味藥、有效成分和復方等方面積極開展了抗腎纖維化的大量研究,取得了一些新進展。中藥三七的主要活性成分是三七總皂苷（panax notoginseng saponins,PNS）,它含有多種單體皂苷,其中以人參皂苷（Rb1、Rg1）、三七皂苷（R1）含有量最高［3］。多年的藥理學研究發現三七總皂苷及其主要單體成分具有抗炎、抗纖維化、抗氧化、抗腫瘤、抗心血管疾病、改善微循環等作用［4-6］,隨著研究的日益深入,其抗纖維化的作用顯得尤為突出。實現腎纖維化的延緩、逆轉甚至消除,有必要提高對腎纖維化進展的細胞和分子機制的認識。

1 腎纖維化發生的細胞和分子機制

當腎臟受到創傷、感染、血液循環障礙、免疫反應等多種致病因素刺激時,腎臟固有細胞受損,后期發展到大量膠原沉積和積聚,造成腎實質逐漸硬化,形成瘢痕,直至腎臟功能完全喪失。腎臟內固有細胞纖維化、硬化的過程就是腎臟纖維化的過程,在這一過程中會引發復雜的細胞、分子級聯反應,最后導致腎小球和間質區大量的ECM異常沉積。這種組織學表現的潛在細胞學機制更復雜,損傷（如高糖、各種有害刺激等）而引起的大量炎性細胞浸潤,各種來源的肌成纖維細胞的激活和擴張,生產和沉積大量ECM成分,以及腎小管萎縮和微血管稀疏,造成腎臟纖維化和功能障礙。腎纖維化的過程是由啟動、激活、執行、進展這4個連續動態階段組成［7］。首先,持續損傷引起的炎癥反應啟動了腎臟的纖維化信號,接著多種信號機制激活了多種來源的基質產生細胞,如腎間質纖維細胞、腎臟血管球壁上周細胞、發生表型轉化的腎小管上皮細胞、內皮細胞以及從血液中募集到的循環纖維細胞等。產生基質的細胞構建了一個多組分整合素相關的三元蛋白復合物,它整合了各種纖維蛋白信號并協調ECM的產生及其組裝,造成大量細胞外基質的積聚,最后ECM積累導致形成永久性纖維化瘢痕,并與腎組織重塑有關［8］。ECM成分一旦沉積,并進一步交聯,獲得耐降解特性,導致腎實質的最終破壞和腎功能的喪失。

2 三七總皂苷在防治腎纖維化過程中的調控作用

腎纖維化包括腎小管間質纖維化、腎小球硬化和腎內血管硬化,其中腎小管間質纖維化（Renal tubulointerstitial fibrosis,RIF）是腎臟纖維化的關鍵環節,也是所有進行性腎病的最終結果。腎間質纖維化形成的重要機制有早期損傷引起的炎細胞浸潤為始動因子,在各種細胞因子、致纖維化生長因子等作用下,腎小管、腎間質細胞受到損傷,同時腎臟固有細胞被活化,細胞外基質成分的產生與降解過程失衡,導致大量基質成分的過度積聚。近年來中醫藥三七及三七總皂苷在防治腎纖維化相關疾病方面取得了較好的臨床療效和實驗研究。

2.1 三七對損傷引起炎癥致腎纖維化的影響 炎癥作為一個整體在腎纖維化發生中起著至關重要的作用［9］。各種持續損傷引起炎癥,在腎臟受損部位積累大量的細胞粘附分子、趨化因子、細胞因子和粒一單核細胞集落刺激因子。炎細胞（包括吞噬細胞和淋巴細胞）在這些刺激因子吸引下趨化到達炎癥局部,引起了腎臟纖維化。大量的研究證據表明,腎臟局部炎癥在腎纖維化的發生和發展過程中扮演重要的角色,有研究人員在慢性腎臟?。–KD）患者體內發現一些炎癥信號分子基因表達上調［10］,包括：單核細胞趨化蛋白-1 （MCP-1）、緩激肽B1受體（B1R）、核因子κB （NF-κB）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、轉化生長因子-β （TGF-β）和血小板衍生生長因子（PDGF）。大量研究證實酪氨酸激酶（JAK）/轉錄因子（STAT）信號通路在促進炎癥的發生發展中具有重要作用［11-12］,Chow等［13］實驗研究發現三七總皂苷可通過抑制JAK/ STAT信號通路的表達,減輕巨噬細胞在損傷部位的浸潤,緩解巨噬細胞介導的炎癥反應,從而減慢腎纖維化的進展。黃志敏等［14］利用三七注射液觀察阿霉素誘導的腎纖維化大鼠炎癥因子水平,認為三七注射液可能參與阻斷JAK/STAT信號通路,從而發揮抗腎纖維化作用。大多數白細胞介素是促炎性細胞因子,主要通過刺激炎癥和自身免疫相關基因的表達,誘導環氧化酶2、磷脂酶A2、一氧化氮合酶、干擾素γ、粘附分子等效應蛋白的表達,在免疫調節及炎癥進程中扮演著重要的角色。近年來,經研究發現促炎細胞因子白細胞介素-17 （IL-17）已與幾種慢性炎癥疾病有關,這些疾病往往以器官損傷、傷口愈合受損和纖維化告終［15］。研究表明白細胞介素1a能誘導正常大鼠腎小管上皮細胞的轉分化,王宓等［16］研究發現三七總皂苷（PNS）明顯抑制這種轉分化作用,進一步研究證實了三七總皂苷（PNS）也對平滑肌肌動蛋白表達有抑制作用,并且這種抑制作用與對纖維連接蛋白分泌的抑制作用呈正相關性。吳金玉等［17］發現三七注射液可能通過下調腎組織Toll樣受體（TLR1、TLR2）蛋白表達,減少炎癥補體C3a、C5a水平,來調節補體-炎癥受體系統,從而發揮中藥三七抗腎纖維化的作用。

激活的炎細胞會產生破壞組織的氧化應激信號分子,如反應性活性氧（ROS）,并誘導纖維化細胞因子和生長因子的產生。有研究［18-19］證實鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病腎病模型大鼠腎臟組織細胞中自由基和氧化應激水平就異常高,而三七總皂苷通過發揮抗氧化作用,抑制糖尿病大鼠腎臟氧化應激,對糖尿病大鼠腎臟起重要的保護作用。

2.2 三七對腎纖維化時促纖維化細胞因子的影響 局部浸潤的炎細胞合成并釋放纖維化性細胞因子,刺激大量的成纖維細胞增生,促使膠原大量合成,導致腎間質纖維化逐漸形成。此時,肌成纖維細胞通過多種機制激活［20］,細胞因子（TGF-β1,IL-13,IL-21）、血管生成因子（VEGF）、趨化因子（MIP-1β,MCP-1）、生長因子（PDGF）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）、半胱氨酸蛋白酶、急性期蛋白（SAP）和腎素-血管緊張素-醛固酮系統（ANGⅡ）的組分已被檢測并確定,目前它們已成為纖維化的重要調節劑,并且現在正在把它們作為抗纖維化的潛在靶標進行著大量研究。近年來一系列體外腎細胞培養和實驗動物模型的研究表明,TGF-β1被認為是腎臟纖維化的中心調控者,是腎臟疾病慢性進展的主要因素,TGF-β1過度表達可導致腎小球硬化及腎間質纖維化（RIF）［21］。TGF-β1可通過自噬［22］、上皮間質轉化［23］等途徑對腎小管上皮細胞、足細胞和腎間質產生影響,造成腎臟纖維化。Schiffer等［24］研究發現Smad蛋白作為TGF-β 信號轉導的細胞內重要介質發揮作用,Smad通路在糖尿病小鼠腎臟中被激活,Smad3介導腎小球系膜細胞中TGF-β 誘導的纖連蛋白。TGF-β/ Smad信號傳導系統刺激腎小球系膜細胞膠原蛋白的大量表達。Isono等［25］用鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠證實Smad3過度表達增加了纖維連接蛋白啟動子的活性,用顯性負性Smad3或抑制性Smad7轉染可阻止纖連蛋白啟動子的TGF-β 刺激活性。認為高血糖會激活腎內TGF-β/Smad信號通路,進而促進糖尿病腎病中腎小球系膜基質基因的表達。Fujimoto等［26］也證實高血糖激活腎內TGF-β/Smad信號通路,然后促進腎小球系膜基質基因在糖尿病腎病中的表達。研究發現使用各種策略抑制TGF-β/ Smads信號傳導途徑顯著減少腎纖維化病變并改善腎損傷,表明靶向TGF-β/ Smads信號傳導途徑可能是有效治療的新策略［27］,這為腎纖維化的治療提供了一個新的方法。TGF-β細胞因子不僅參與促使腎臟纖維化進程,而且還參與了腎臟中幾種基本細胞反應的控制,包括炎癥、程序性細胞死亡、細胞生長、細胞分化和細胞肥大。這說明細胞因子TGF-β 的生物學效應廣泛且復雜,如果僅僅單純抑制其活性會產生諸多不良反應,所以這就限制了TGF-β 作為腎臟纖維化治療靶向藥物的應用價值。諸多研究發現在腎臟疾病過程中,TGF-β2刺激纖維化結締組織生長因子（CTGF）的表達,誘導成纖維細胞增生、基質蛋白質合成和整合素的表達,促進腎臟纖維化發展進程。因此結締組織生長因子作為TGF-β 的下游因子,是其活性的重要調節者,效應相對簡單,因此結締組織生長因子成為抗纖維化的新靶標。Ren等［28］發現人參皂苷Rg1和黃芪甲苷Ⅳ的組合可降低氧化應激并抑制TGF-β1/ Smads信號通路在糖尿病腎病大鼠腎纖維化中的級聯作用。席加喜等［29］采用順鉑尾靜脈注射建立腎損傷模型,研究發現三七總皂苷（PNS）能有效改善順鉑致腎損傷模型大鼠的腎功能,其可能通過下調腎組織中腎纖維化相關性因子CTGF、TGF-β1、Col-1、金屬蛋白酶組織抑制劑-1 （TIMP-1）、纖溶酶原激活抑制劑（PAI-1）的表達,從而發揮減輕順鉑致腎纖維化的作用。

2.3 三七總皂苷對腎纖維化時肌成纖維細胞形成的影響 經細胞因子活化的成纖維細胞大量增生,合成基質膠原蛋白。同時,腎組織中的腎小管細胞自身也釋放細胞因子如TGF-β,直接刺激成纖維細胞的活化和增殖,并促進成纖維細胞分泌細胞外基質,使ECM積聚,從而形成腎間質纖維化。通過譜系示蹤和免疫熒光顯微鏡技術證實,肌成纖維細胞可能來自多種來源［30］,如血管壁周細胞、活化的腎成纖維細胞、上皮-間質轉化（EMT）成纖維細胞、內皮間質轉化（EndoMT）成纖維細胞和源自骨髓的成纖維細胞樣細胞。研究表明［31］從骨髓中募集的巨噬細胞可以直接過渡到受損腎臟內的肌成纖維細胞,稱為MMT過渡。其中周細胞是腎臟纖維化過程中肌成纖維細胞的主要來源?；罨某衫w維細胞產生細胞外基質,促使腎纖維化的發展。研究發現,AMP活化蛋白激酶（AMPK）在成纖維細胞活化和腎纖維化發展中起著重要作用。AMPK可能是通過調節細胞骨架動力學和心肌素相關的轉錄因子-A核易位實現成纖維細胞的活化。因此,AMPK信號傳導作為成纖維細胞活化的關鍵調節因子,成為纖維化腎病的新治療靶標［32］。蘇白海等［33-34］通過單側輸尿管梗阻（UUO）腎間質纖維化腎病的大鼠的實驗發現,三七總皂苷能阻斷腎小管上皮細胞的上皮-間質轉化（EMT）,即抑制上皮細胞向肌成纖維細胞轉化,修復腎小管上皮細胞,PNS對UUO所致的大鼠腎臟纖維化的形成有明顯的抑制作用。韋穎等［35］在體外培養人腎成纖維細胞（KFB）發現,三七總皂苷PNS在最佳濃度范圍和作用時間內可明顯抑制KFB細胞增殖及分泌Ⅰ型膠原蛋白,同時顯著降低了KFB細胞的整合素β1的表達,PNS可能是預防和治療腎間質纖維化的有效藥物。

2.4 三七總皂苷對腎纖維化ECM積聚和降解的影響 在正常成人腎臟中,成纖維細胞位于毛細血管和上皮細胞之間,成纖維細胞通過產生基礎水平的ECM成分維持生理條件下的間質組織結構的穩態。在腎臟損傷時,成纖維細胞被促纖維化細胞因子和體內機械應力激活,表達α 平滑肌肌動蛋白（α-SMA）,并產生大量ECM組分而獲得肌成纖維細胞表型。致纖維化因子在促進ECM合成同時,還抑制ECM降解酶系,致使正常的平衡穩態被打破,細胞外基質（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白等）過度積累。在腎臟中發現基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）/基質金屬蛋白酶組織抑制劑1 （tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）是調控細胞外基質的重要酶系。據研究發現在各種原因所致的腎纖維化組織中ECM降解酶系抑制確實起關鍵作用。謝席勝等［36］在單側輸尿管梗阻（UUO）腎間質纖維化模型大鼠,觀察發現模型大鼠腎組織中TIMP-1蛋白表達上調,但經PNS和氯沙坦治療后,TIMP-1表達量明顯下降,并不同程度地減輕了膠原在腎間質的沉積,改善了腎臟病理損害。趙宗江等［37］通過采用單側腎切除結合腺嘌呤灌胃RIF模型大鼠中發現,PNS改善模型大鼠微循環、緩解腎組織的水腫、減輕腎小管間質炎細胞的浸潤,減少腎小管上皮細胞的凋亡、脫落,從而延緩慢性腎間質纖維化的病程進展。席加喜等［29］用三七總皂苷（PNS）對順鉑尾靜脈注射腎損傷SD大鼠實驗研究發現,PNS可能通過下調模型大鼠腎組織中腎纖維化相關性因子CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的表達,從而發揮減輕順鉑致腎纖維化的作用。

2.5 三七總皂苷對腎小管損傷、萎縮及微血管減少的影響 正常的腎小管上皮細胞吸收原尿中一些物質,并能分泌多種細胞因子,代謝旺盛,具有一定的潛在增殖能力。在缺氧、蛋白尿及多種炎癥/細胞因子作用下,腎小管上皮細胞可活化、增殖,并分泌多種炎癥因子、趨化因子和血管活性因子進入腎間質,加重腎間質的炎癥和纖維化進程。受損的腎小管上皮細胞除了發生壞死或凋亡外,還可能發生表型轉化為肌纖維母細胞進入間質,直接參與腎間質纖維化。因此,腎小管上皮細胞損傷和損傷后的反應是加重腎間質炎癥、纖維化和慢性腎臟持續進展的重要因素。研究發現Bcl-2是細胞凋亡抑制基因,Bax不僅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用,而且具有促進細胞凋亡的功能。因此Bcl-2/Bax決定細胞凋亡抑制作用強弱。陳丑彥［38］發現三七總皂苷可上調Bcl-2 mRNA的轉錄與蛋白的表達,下調的BaxmRNA轉錄與蛋白的表達,從而抑制腎小管上皮細胞凋亡,進而對腎臟的損傷起保護作用。Liu等［39］通過實驗的研究表明三七總皂苷（PNS）顯著免受順鉑誘導的腎毒性,而且PNS降低腎小管細胞的凋亡率,其作用機制是PNS可以抑制Bax及caspase9的表達,而增加的Bcl-2的表達。因此PNS通過抑制線粒體途徑減輕腎組織細胞凋亡,防止順鉑引起的腎毒性。

研究表明腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化（tubular epithelial-myofibroblast transition,TEMT）,并分泌細胞外基質ECM,從而導致RIF的發生發展,所以TEMT可能是各種進展性腎臟疾病發生RIF的重要機制之一［40］。研究證實三七總皂苷治療腎纖維化的作用機制之一,可能是通過抑制腎小管上皮細胞轉分化而延緩腎小管一間質纖維化的進展。姚恒等［41］通過IL-1α 誘導體外培養的大鼠腎小管上皮細胞（NRK52E）,發現腎小管上皮細胞呈梭狀增厚,α-SMA表達明顯增強,FN分泌增加,向肌成纖維細胞轉分化。加入不同濃度的PNS后,細胞形態恢復接近正常,隨著α-SMA表達量的增加和FN分泌量的增加,細胞形態明顯受到劑量依賴性的抑制。說明三七總皂苷（PNS）通過阻斷IL-1α 誘導的腎小管上皮細胞,減少細胞外基質（ECM）的分泌,預防腎間質纖維化的發生。林琳等［42］通過對高糖誘導的人腎小管上皮細胞（HK-2）體外培養發現高糖組細胞變為梭形長條樣,α-SMA的表達也明顯增多,經加入PNS處理后,大部分細胞α-SMA的表達明顯下降且與TGF-β1與FN的表達呈正相關。進一步證實PNS可能通過抑制腎小管上皮細胞轉分化降低α-SMA的表達,進而控制糖尿病腎纖維化發展進程。在對單側輸尿管梗阻大鼠腎纖維化的影響中發現,腎臟組織學檢查顯示［32］,人參皂苷Rg1對腎小管損傷及膠原沉積等間質纖維化有明顯抑制作用。轉化生長因子β1 （TGF-β1）是調節TEMT的關鍵介質,其信使RNA （mRNA）在梗阻腎組織中顯著升高,但經人參皂苷Rg1處理后顯著降低。進一步研究表明,人參皂苷Rg1顯著降低了活化的TGF-β1和磷酸化的Smad2（pSmad2）水平。以上結果提示人參皂苷Rg1可能與通過抑制sp -1的表達而阻斷TEMT,從而具有改善腎間質纖維化的作用。劉靜等［43］通過腺嘌呤灌胃法致腎間質纖維化模型大鼠的實驗研究發現,三七總皂苷PNS可能通過下調a-SMA和ICAM-1的表達,抑制腎小管上皮細胞和成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞,從而阻斷腎間質纖維化的發生。

3 總結與展望

腎纖維化是大多數慢性腎臟疾病的最后階段,并導致腎功能的進行性和不可逆轉的下降。腎纖維化是一個發生發展的復雜病理過程,損傷引起的炎癥反應促使促纖維化細胞因子、趨化因子和生長因子的釋放,招募成纖維細胞并激活分泌ECM,ECM積累導致形成永久性纖維化瘢痕,最終導致腎功能衰竭。

目前,臨床上不僅在單一治療中,而且在聯合治療中,都沒有找到阻滯腎纖維化的藥物,這可能是因為腎纖維化是一個涉及多種細胞類型和分子參與的復雜過程。中藥三七可通過低毒性、多成分、多靶點獨特的優勢對慢性腎臟病防治有很好的療效,多年的藥理學研究發現三七總皂苷及其主要單體成分具有抗纖維化作用,通過對近20年來三七及三七總皂苷抗腎臟纖維化的體外腎細胞培養和實驗動物模型的研究發現,三七及其活性成分抗腎臟纖維化作用機制,主要包括減少炎癥細胞的聚集,下調腎組織中腎纖維化相關性因子表達,抑制整合素、TGF-β1的表達,抑制腎小管上皮細胞轉分化（TEMT）,抑制人腎間質肌成纖維細胞的增殖,調節并減少ECM的積聚,減輕腎臟纖維化并抑制慢性腎臟病的進展。盡管中藥材三七主要活性成分PNS、G-Rg1、G-Rb1的化學結構明確,但對三七的某一有效成分提取物抗纖維化的研究,卻不能很好的解釋中藥多靶點調控細胞信號通路的機制,再加上致腎纖維化信號通路錯綜復雜,信號通路之間相互作用、互相影響,致使相關研究顯得尤為困難。隨著對腎纖維化的研究逐漸深入,也發現了一些極有希望的靶標分子,如ANG Ⅱ、TGF-β、CTGF、AMPK、MMT、小分子RNA （一種小的非編碼RNA分子,miR-21）等。目前理清這些致腎纖維化的信號級聯反應之間的相互作用,找到致纖維化的關鍵蛋白,定會為腎纖維化的預防、治療帶來新的思路,為揭示慢性腎臟病進展的潛在機制和確定新的治療靶點提供基礎。因此,探究三七總皂苷PNS抗腎纖維化的發病機制的細胞和分子基礎,以期獲得對該過程的發病機理的新見解,而且為開發腎纖維化新治療靶標藥物奠定基礎。