血友病鼠關節病模型構建研究進展

孫慶云閆振宇

(1. 華北理工大學，河北唐山 063000；2. 華北理工大學附屬醫院，河北唐山 063000)

血友病是一種遺傳性X 染色體相關出血性疾病，主要是由FVIII 或FIX 異常引起。 全球約有40 萬人受累，男性發病率遠大于女性，大約每5000 個男性新生兒中有1 例為血友病A 患者，大約每30000 個男性新生兒中有1 例為血友病B 患者[1]。 在臨床上，血友病A和B 難以區分，診斷必須通過分析特異性因子來確定，根據Ⅷ因子和Ⅸ因子的水平分為：重型(≤1%)、中型(2% ～5%)、輕型(6% ～40%)[2]。 重型血友病常表現為為關節和肌肉自發性出血，復發性出血導致滑膜肥厚、軟骨損傷、關節間隙丟失和骨質改變，靶關節活動的減少導致肌肉持續性萎縮、關節強直、骨質疏松，最終導致血友病性關節病[3-7]。

血友病性關節病發病機制復雜，包括軟骨代謝紊亂，軟骨細胞凋亡加速，滑膜細胞異常增殖以及滑膜液中炎性分子水平增加等，同時，其發病的危險因素也較多，例如治療情況，功能鍛煉，肥胖，年齡等[8]。 其患者的四肢任何關節都可發生關節積血，其中膝、肘和踝關節居多，而髖部、肩部和腕部受累較少見[9]。 從長期來看，治療不當的患者常常會因進展性關節病而喪失活動能力[10]。 目前血友病性關節病的治療包括預防治療，物理治療，關節腔穿刺，關節置換術等[11]。 對于血友病，最主要的治療還是預防治療，如果不進行預防，大多數重型血友病患者將在2 ～5 歲之間發生關節內出血，并在其二三十歲時發生血友病性關節病[12]。Manco-Johnson 等[13]發現血友病患者關節或軟骨下骨中的慢性微出血會導致沒有臨床證據的關節惡化，而預防治療可以阻止這一亞臨床過程。 主要的檢測方法是通過放射學或磁共振成像(MRI)來評估關節的損傷程度，當顯示軟骨下囊腫、表面糜爛或關節間隙變窄即可定義為關節損傷，根據關節的出血次數和關節結構的改變，得知預防治療和按需治療均有不同程度的關節結構改變，但預防治療的關節結構的正常率大于按需治療的患者。 且有研究表明，90%以上接受預防性治療的患者在30 ～40 歲時出現關節病變[14-15]。 隨著進行性關節病患者的健康相關生存質量(HRQoL)的惡化[16-17]，以及為緩解疼痛和改善關節功能而進行的骨科干預治療所需的相關費用的高昂，使血友病性關節病的預防治療成為血友病治療的主要目標。

目前，膠原誘導性關節炎模型是國際上公認的關節炎模型[18]。 但由于血友病的自發性出血，不適于這種構建方式。 目前已經成功構建的血友病動物模型包括血友病犬、綿羊、大鼠、小鼠和豬，但其中血友病犬、綿羊，豬多由自發性基因突變形成，而血友病鼠通常是通過破壞靶向基因而構建相應的模型[19]。 在相關研究中，犬類、綿羊、豬類模型容易受到實驗動物數量的限制，而兔類模型容易受到模型構建的限制[20]，因而通過使用血友病鼠類模型，創建一個新的血友病性關節病動物模型成為研究者的最佳選擇，以便進一步研究血友病性關節病的發病機制以及預防治療。

1 血友病性關節病小鼠模型的建立

2008 年，Hakobyan 等[21]通過使用F8 基因敲除的重型血友病A 小鼠(E16 FVIII B6；129S4-F8tm1kaz/J)[22-23]，由 Dr Haig Kazazian ( University of Pennsylvania，Philadelphia，PA，USA)提供，F9 基因敲除的重型血友病B 小鼠(B6；129P2-F9tm1Dws/J)[24]，由 Darrel Stafford(Department of Biology，University of North Carolina at Chapel Hill)提供，和野生型小鼠(C57BL/6J)，購買自Jackson 實驗室(Bar Harbor，ME，USA)。 三種小鼠菌株成功構建血友病性關節病小鼠模型。 該研究得到了Institutional Animal Care 和Use Committee of RUSH University 的審查和批準，實驗中所有小鼠都按照委員會的指導方針進行了維護和治療。A、B 型血友病小鼠關節病模型的構建方法相同。 在實驗中通過用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉3 ～4 月齡的小鼠，剪除雙側膝關節毛發，使用30 g 針在每只小鼠的右膝關節囊髕骨下穿刺一次出血。 部分小鼠在關節損傷前接受人重組因子VIII(recombinant human coagulation VIII，rhFVIII)靜脈注射，劑量為280 U/kg(相當于100%校正)，每只動物左膝作為未受影響的對照組，檢查被穿刺關節是否出血，并在穿刺后24 h 皮下注射止痛劑。動物在受傷后特定時間被處死，并測量小鼠膝關節從外側到內測的最大直徑[20]，隨后對小鼠的膝關節進行組織學檢查，并進行數字成像、X 線平片和顯微計算機斷層掃描成像，并對結果進行分析。 結果顯示在單個且大量的關節積血后，血友病小鼠在14 d 后發生關節病，顯微CT 也證明關節結構損傷與Manco-Johnson 的研究結果一致[13]。 通過這些研究指標初步證明，血友病性關節病小鼠模型的成功構建。

2 血友病性關節病小鼠模型的應用研究

血友病性關節病小鼠模型的成功構建，推動了研究者對于該種疾病的研究進展，為此后關于該疾病的各項實驗，提供了必要的動物模型支持條件。 2008 年，Sun 等[25]使用該模型，向小鼠關節內或靜脈注射人凝血因子IX(human coagulation IX，hFIX)，發現接受關節內注射的小鼠免于滑膜炎的侵害。 隨后在此基礎上，他們將表達hFIX 的腺相關病毒(AAV)基因轉移載體注射到血友病B 小鼠的膝關節，結果顯示用載體治療的關節在損傷后2 周出現的病理改變明顯減少，證明在沒有循環FIX 的情況下，血管外因子活性和關節導向基因轉移可改善血友病性關節病。 2013 年，Coeleveld 等[26]在細胞因子的聯合應用在早期軟骨損傷過程中是否有效的實驗研究中，通過針刺誘導血友病小鼠關節出血，將IL-4 和IL-10 的混合溶劑和對照溶劑分別注射到關節腔內，通過觀察35 d 后關節的損傷程度，同時檢測關節退化所需的時間，證明關節出血后單次關節內注射IL-4 和IL-10 的混合試劑可限制血液誘導的軟骨退變，而且提高兩種因子的生物利用度會提高其在軟骨退變中的保護作用。 由于許多編碼細胞因子、生長因子和缺氧調節因子的基因均可被NFκB 激活，且其中許多基因是關節疾病發病機制的一部分，因此推斷NF-κB 相關通路可能在血液誘導的關節損傷中起關鍵作用。 為進一步了解其作用機制，Sen等[27]在2013 年使用血友病性關節病小鼠模型，監測傷后一定時間內NF-κB 相關因子的表達，結果發現顯著上調，由此表明NF-κB 相關的信號通路參與血友病性關節病的發生。 隨后在2016 年，Hakobyan 等[28]再次使用血友病小鼠關節積血模型，對可見出血評估(VBA)，關節直徑(JD)，關節外出血評分(EBS)和關節內出血評分(IBS)4 項指標進行了評估，將EBS 和IBS兩項指標總結為關節出血評價系統(BSS)，為臨床前止血藥物的開發提供了一個新的、有價值的補充。 2018年，Haxaire 等[29]發現針刺誘導關節出血導致FVIII 缺陷小鼠損傷關節中TNF-α 水平升高，且TNF-α 或iRhom2 失活可減少血友病性關節病小鼠模型中出現的骨質減少和滑膜炎癥，由此可知血液進入關節激活了iRhom2/ADAM17/TNF-α 途徑，從而導致小鼠骨質減少和滑膜炎，因此，該促炎信號通路成為預防血友病關節病患者骨質疏松和關節損傷的新靶點。

上述多項研究中應用了血友病性關節病小鼠模型，說明其模型適用于該疾病實驗研究，具有可用性。其體型大小使其易于運輸。 但是不可否認，其仍具有尚未完善的部分。 小鼠模型的主要缺點是缺乏自發性出血表型，并且只能分析小體積的血液樣本，這限制了該模型的適用性，從而無法深入了解再出血的機制[30]。雖然血友病犬表現自發性出血表型，且與人類有明顯的F8 基因同源性，每年出血發作1 ～5 次，但是其繁殖率較低并且支持研究所需的設施昂貴，并且很難在研究中接觸到大量動物。 血友病綿羊與血友病豬具有體型和自發性出血表型的優勢，但管理起來相當費力[19，31-32]。 因此，就要求其他合適的關節病動物模型的構建，使其更適于其他深入研究。 有研究表明[30]，血友病大鼠與人類血友病患者具有相似的表型，表現為血液循環受損和自發性肌肉骨骼出血，與血友病小鼠相比，血友病大鼠的身體和血容量約為小鼠的10 倍，且允許更大和更頻繁的血液采樣。 根據指導方針[33]，25 g 的小鼠一周內只能采集135 IL 的血液樣本，而250 g 的大鼠一周可以采集1200 IL 的血液樣本，這有助于在縱向疾病進展研究中大鼠作為自身基線對照，從而改進研究設計，并減少所需要的動物數量。 此外，大鼠具有與小鼠相同的繁殖和住房優勢，且大鼠體型較大也可進行臨床相關成像。 由此可知，血友病性關節病大鼠模型將更受到研究者的青睞。

3 血友病性關節病大鼠模型的構建

2016 年，S?rensen 等[34]人通過使用13～15 周齡的F8-/-大鼠(SD-F8tm1sage)在Sprague Dawley 背景下，飼養于Novo Nordisk A/S(Maaloev，Denmark)，和野生型大鼠成功構建血友病關節病大鼠模型。 該研究得到了Danish Ministry of Justice 的批準，實驗中所有動物都根據Danish Animal Experiments Council 的指導方針進行。 大鼠飼養在標準條件下，光照/黑暗周期為12 h/12 h，溫度為20 ～23 ℃，相對濕度為30% ～60%，自由進食和飲水，每天監測出血體征。 F8-/-大鼠的數據曾報道過，證實F8-/-大鼠是血友病A 的轉化動物模型[30]。 在實驗中用5%異氟烷、0.7 L/min O2、0.3 L/min N2O 誘導，2%異氟烷、0.7 L/min O2、0.3 L/min N2O 維持麻醉，在吸入麻醉下進行所有入侵手術。 將20 只野生型大鼠和60 只F8-/-大鼠，隨機分配到兩個損傷類型，一組(10 只野生型大鼠和40 只F8-/-大鼠)在第0 天接受單次針刺誘導出血，在第14 天處死。 另一組(10 只野生型大鼠和20 只F8-/-大鼠)在第0 天和第14 天分別接受針刺誘導出血，在第28 天處死，目的是研究再次出血是否會加重血友病性關節病的進展。在接受針刺誘導出血前，F8-/-大鼠按1 ∶1隨機分配，接受300 IU/kg rhFVIII 或者相同體積的緩沖液治療。rhFVIII 的劑量是基于F8-/-大鼠血漿中APTT 的體外正?；痆30]，野生型大鼠給予緩沖液。 然后對大鼠進行麻醉，靜脈注射rhFVIII 或緩沖液后，皮下注射丁丙諾啡0.03 mg/kg 鎮痛，有研究表明丁丙諾啡作為鎮痛劑不會影響膝關節出血后的炎癥影響[35]。 剪掉左膝上的毛發，用30 g 針穿過髕骨韌帶，引發關節出血。 在接下來7 d，在飲用水中添加6 mg/L 的丁丙諾啡。

根據慢性關節病變評分系統[36]，組織學評估及日常評估得出，所有未經治療的血友病關節病動物切片的組織病理學評估符合血友病[37-40]。 預防性使用rhFVIII 治療顯著降低了關節的病理，并顯示關節出血臨床癥狀的減少，從而證實了F8-/-大鼠作為血友病關節病相關模型的潛力。 初步證明血友病性關節病大鼠模型構建成功。

4 血友病性關節病大鼠模型的應用研究

眾所周知，凝血因子VIII 替代治療血友病A 最嚴重并發癥是產生中和抗體，為進一步研究出血是否會促進抑制物的形成，2016 年，L?vgren 等[41]將血友病大鼠分為兩組，其中一組接受針刺出血，另一組作為對照，隨后均給予rhFVIII 治療，通過分析結果證明關節出血后給予rhFVIII 治療可加強抑制物的形成，這表明出血是潛在的危險信號，即rhFVIII 替代療法同時并發出血可增加抑制物的形成。 隨后Christensen 等[42]在2017 年使用體內US(Ultrasonography，US)和體外μCT檢測血友病性關節病大鼠的膝關節，觀察到與血友病性關節病相關的病理，并且μCT 確定的疾病嚴重程度與組織病理學之間存在強相關性，rhFVIII 治療可降低兩種成像技術確定的病理，證明US 和μCT 是檢測血友病性關節病的合適成像技術，可用于疾病進展的縱向研究。 研究發現，大多數產生抑制物的血友病患者不能誘導免疫耐受，需要旁路制劑進行長期出血管理。重組人活化凝血因子VII (recombinant human coagulation VII，rhFVIIa)是血友病抑制物患者出血的按需旁路止血劑。 預防性使用rhFVIIa 可以使產生抑制物的患者得到持續的止血治療，但在這種情況下，rhFVIIa 循環水平和臨床結果的關系仍不清楚。 為了解決這一問題，Zintner 等[43]在2019 年使用該大鼠模型，通過腺相關病毒(AAV)基因轉移模擬了大鼠FVIIa轉基因的活化因子VII 預防，與未經處理的血友病性關節病大鼠相比，重組大鼠FVIIa 按需給藥可緩解出血。當大鼠FVIIa 轉基因水平≥708 ng/mL 可減少血友病大鼠的出血，而水平＞1250 ng/mL 則可消除出血。 這些數據首次確定了在模擬FVIIa 預防的環境中，血友病性關節病動物的FVIIa 循環抗原水平和出血比例之間的關系。

上述各項研究表明，血友病性關節病大鼠模型的成功構建為以后的一系列深入研究提供了必要前提。 首先，血友病性關節病大鼠模型可表現出與人類類似的自發性出血表型，其次，大鼠的繁殖優勢可使我們快速獲得具有統計學意義的大隊列數據，以識別治療引起的臨床變化。 相關優勢使得該模型有助于對血友病性關節病的發病機制及治療干預的研究。 但是，由于是自發性出血模型，非預期出血可能給實驗帶來偏倚，且出血量大小未知，這是在以后的實驗中需要克服的一大難題。

5 總結及展望

目前血友病性關節病是血友病最嚴重的并發癥，其并病理生理機制尚不完全清楚，因此構建相應的動物模型，進一步研究其機制，成為了研究者最關注的問題。 實驗鼠因其自身優勢，如繁殖量大，便于管理等成為實驗中最常用的實驗動物。血友病小鼠關節病模型已成功構建，但小鼠采血量小且缺乏自發性出血表型，進而選擇體積相對較大的SD 大鼠，但因其自發性出血，出血量大小未知，也為實驗帶來了一定的困難。 雖然各種動物模型均有利弊，但是實驗動物模型為實驗研究帶來的優勢不容小覷。 總之，建立一種生理指標穩定、模型構建簡單、且易操作的血友病性關節病模型有助于我們對血友病性關節病的發病機制、病理改變的進一步認知，也為新型療法的開發比如基因治療提供了可能，并且為今后的臨床研究打下了堅實的基礎。