不同產地甘草中甘草苷等五種成分的含量比較研究

張黎娟，汪盈盈，李 飛

（1.亳州職業技術學院 藥學院，安徽 亳州 236800 ；2.安徽中醫藥科學院 亳州中醫藥研究所，安徽 亳州 236800；3.亳州市食品藥品檢驗中心，安徽 亳州 236800）

甘草來源于豆科（Leguminosae）植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、脹果甘草（G.inflataBat.）和光果甘草（G.glabra L.）的干燥根和根莖。具有補脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛、清熱解毒、調和諸藥的功效[1-2]。甘草是神農本草經記載的上品常用中藥，在中國甘草應用于臨床的時間已有4 000多年[3]?，F代研究發現甘草的化學成分有三萜類、黃酮類、生物堿、多糖、氨基酸等。隨著對甘草應用的不斷深入研究，中藥納入醫保使用范圍，甘草的消耗量不斷增加，導致甘草的市場需求量不斷增加，并遠超國內的野生產量，采取野生地區計劃性人工種植后，仍無法滿足國內外市場需求。除中國外，中東、中亞及東歐一些國家也擁有豐富的野生甘草資源，2008年起我國施行了進口甘草免關稅，2011年我國甘草進口量為10 659 t，同比增長123 %，進口額為1 012萬美元，同比增長160 %。進口甘草占到我國76 %的甘草進出口貿易量，已成為我國進口中藥材飲片第二大品種[4]。

中藥甘草的質量和影響質量的因素一直是備受關注的研究對象，目前閆永紅、林壽全等[5-7]對國產野生與栽培甘草不同來源、不同產地、不同生長年限所導致的性狀和活性成分含量的差異進行了研究，結果表明因來源、生態環境、生長年限等差異會造成甘草質量上的差別。國內外對甘草的研究多在于活性成分的藥理作用和活性成分的提取分離[8-9]。因土壤、氣候、來源等生長環境的差異，進口甘草與國產甘草質量是否一致，藥用療效是否相同，這都是進口甘草能否用于中醫藥臨床必須解答的問題。對進口甘草在甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸5種活性成分上與國產甘草進行質量一致性評價，期望能發現其中的質量差異，為今后的進口甘草應用于中醫臨床和深入研究提供參考。

高曉娟等考證古代文獻發現國產甘草的核心產區從以山西為主產區變遷為今天的以西北地區（內蒙古、甘肅、新疆、寧夏）為主要產區[10]。烏拉爾甘草分布于內蒙、甘肅、寧夏、新疆、青海、陜西、山西、河北、遼寧、吉林、黑龍江，脹果甘草分布于甘肅、新疆、陜西、山西，光果甘草分布于新疆、青海。林壽全等研究表明生態因子對甘草質量有影響，認為不同產區的甘草在性狀和有效成分含量上有顯著差異。在中東、中亞及東歐一些國家也擁有豐富的野生甘草資源，例如土庫曼斯坦、烏茲別克斯坦、哈薩克斯坦、阿塞拜疆、巴基斯坦、塔吉克斯坦、阿富汗等地皆有野生甘草資源分布，并向中國出口[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀（包括 G1311C四元單泵、G1329B 進樣器、G1316A紫外檢測器、Technoiogies工作站）；十萬分之一電子天平（上海儀科儀器有限公司）；數顯式電熱恒溫水浴鍋（廣州市海數實驗儀器制造廠）；700VDE型數控超聲波清洗器（合肥金龍克機械制造有限公司）；EV321真空旋轉蒸發儀（LadTech）；SHZ-DⅢ予華牌循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；UORII-207優普系列超純水器（四川優普超純科技有限公司）。

1.2 材料

國產甘草購于亳州中藥市場；進口甘草（烏茲別克斯坦、哈薩克斯坦、巴基斯坦、吉爾吉斯斯坦）來源于國家中藥材質量監督檢查中心，經蔣磊副主任中藥師鑒定為脹果甘草（G.inflataBat）；甘草苷對照品（批號18030905）、甘草酸銨對照品（批號18012902）、甘草素對照品（批號17112302）、異甘草苷對照品（批號17042102）、異甘草素對照品（批號17072104，成都普菲德生物科技有限公司）；磷酸（批號151005，上海展云化工有限公司）；甲醇（批號20170712）、無水乙醇（批號20170612）、乙腈（批號20180103），來源于國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水均為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津 Inerisil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.85 %磷酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相 B，梯度洗脫（見表1），柱溫 25 ℃，檢測波長237 nm，流速 1.0 mL/min[11]。上述色譜條件下，甘草苷、甘草酸、異甘草苷、甘草素、異甘草素對照品高效液相色譜圖，見圖1。

表1 梯度洗脫程序/%

圖1 甘草混合對照品溶液HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約2.0 g，精密稱定，置 250 mL錐形瓶中，加入80%乙醇40 mL，浸泡提取3次，合并收集3次濾液，減壓旋轉蒸發至5 mL，加70 %乙醇定容于25 mL容量瓶中，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取減壓干燥4 h的甘草苷對照品10.23 mg、異甘草苷對照品13.25 mg、甘草素對照品11.20 mg、甘草酸銨對照品11.21 mg、異甘草素對照品10.61 mg，置于50 mL容量瓶，用70 %乙醇定容至刻度線，分別精密吸取 2.0、2.0、0.5、2.0、1.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，用 70%乙醇定容，搖勻，得濃度分別為 0.040 9、0.053 0、0.011 2、0.044 8、0.021 2 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察

分別精密吸取混合對照品溶液 0.5、1、5、10、15 μL 進樣，記錄色譜峰面積，以進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，計算回歸方程。甘草苷：Y=40.879X+12.134，r=0.998 5，線性范圍 0.020 5～0.613 05 μg；異甘草苷：Y=48.4X+0.453 09，r=1，線性范圍 0.026 5～0.705 0 μg；甘草素：Y=25.475X+2.000 05，r=0.999 9 線性范圍 0.005 6 ～ 0.168 0 μg；甘草酸：Y=13.526X+1.299 09，r=0.999 07；線性范圍 0.022 4～ 0.672 0 μg；異甘草素：Y=27.706X+0.735 08，r=1；線性范圍 0.010 6～ 0.318 00 μg。各成分在線性范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗

精密吸取同一批國產甘草供試品溶液 10 μL，連續進樣 5 次，記錄色譜峰面積。結果甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素峰面積 RSD 分別為1.74%、0.96%、1.27%、1.54%、1.69%。

2.4.3 穩定性試驗

取國產甘草供試品溶液，分別在 0、2、4、8、16、24 h 進樣 10 μL，記錄色譜峰面積，RSD 分別為1.67 %、0.98 %、1.29 %、1.49 %、1.57 %，表明供試品溶液在24 h 內基本穩定。

2.4.4 重復性試驗

取同一批國產甘草粉末5份，2.001 9 g、2.001 2 g、2.001 0 g、2.002 1 g、2.002 2 g、精密稱定，制備5份試品溶液，進樣 10 μL，記錄色譜峰面積。甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素平均含量分別為 7.295、0.956、0.180、17.347、0.175 mg/g。RSD 分別為1.49 %、0.95 %、1.24 %、1.43 %、1.27 %。

2.4.5 加樣回收率

取已知含量的同一批國產甘草粉末5份，2.002 5 g、2.001 4 g、2.001 5 g、2.000 3 g、2.002 0 g，精密稱定，制備供試品溶液，每份加入相應質量的對照品，進樣 10 μL分析。計算甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸及異甘草素平均加樣回收率分別為98.98 %、99.45 %、96.97 %、99.46 %、96.85 %（見表2），實驗結果表明本法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗結果

2.5 甘草含量測定

取甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素混合對照品溶液，制備巴基斯坦進口甘草、哈薩克斯坦進口甘草、吉爾吉斯斯坦進口甘草、烏茲別克斯坦進口甘草、國產甘草供試品溶液，進樣10 μL 分析。

圖2 不同產地的甘草色譜圖色譜圖

表3 進口甘草與國產甘草甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素含量測定結果/（mg/g）

3 討論

實驗對不同提取方法進行比較，溫浸法提取甘草素、異甘草素、異甘草苷效果優于加熱回流法和超聲法，且甘草苷、甘草酸的提取效果亦良好。確定了色譜柱為 ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.85 %磷酸水溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫，柱溫25 ℃，檢測波長237 nm，流速1.0 mL/min的色譜條件測定甘草素、甘草苷、異甘草素、甘草酸、異甘草苷5種活性成分結果準確，可靠。

本實驗測定了進口甘草和國產甘草中的甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素的含量。測定結果表明甘草苷含量以國產甘草最高。進口甘草與國產甘草在甘草素成分上存在明顯質量差異。