不同發育時期亞麻莖稈中木質素積累相關miRNA及其靶基因的挖掘分析

謝冬微 孫健

謝冬微（1982-），博士，主要從事亞麻種質資源優異基因挖掘研究工作，在作物種質資源創新和新品種選育方面積累了豐富的經驗，理論基礎夯實，科研業績優異，被評為中國農業科學院麻類研究所科技創新工程“骨干專家”、中國農業科學院2018年度“優秀博士后”。先后主持國家自然科學基金青年項目1項，中國博士后自然科學基金面上項目1項，黑龍江省自然科學基金面上項目1項，以及其他地廳級科研項目5項。以第一作者在《Theoretical and Applied Genetics》《Frontiers in Plant Science》《Plant Science》《BMC Genomics》《Molecular Breeding》等SCI或EI收錄期刊發表科技論文10篇，在《南方農業學報》《麥類作物學報》《大豆科學》《中國麻業科學》等國內核心期刊發表中文科技論文7篇。

摘要：【目的】深入挖掘分析亞麻莖稈不同發育時期木質素積累相關的miRNA及其靶基因，為解析亞麻纖維層木質素動態積累提供理論依據?！痉椒ā恳噪p亞4號（低木質素）和NEW（高木質素）花后20、30和40 d的莖稈為試驗材料，基于miRNA測序和降解組測序結果分析miRNA轉錄水平動態變化及其靶基因注釋功能，并采用實時熒光定量PCR檢測2個亞麻品種間表達差異最顯著的miRNA及其靶基因的表達模式?！窘Y果】構建雙亞4號和NEW花后20、30和40 d莖稈的miRNA文庫，從中鑒定出305個miRNA，包括143個保守的miRNA和162個新鑒定的miRNA，且這些miRNA的靶基因不同轉錄本并非均受miRNA調控。將鑒定的305個miRNA與亞麻基因組序列信息進行靶基因預測，結果鑒定出286個miRNA的4807個靶基因，另外19個miRNA未預測到靶基因。通過對降解組測序數據進行整合分析，共獲得21個miRNA的97個靶基因，共檢測到97個降解位點，僅占鑒定出亞麻莖稈中miRNA靶基因總數（4807個）的2%，仍有大量的靶基因未被鑒定。對降解組中被降解的97個靶基因進行功能注釋，發現有22個與植物生長發育有關，16個為轉錄因子，7個與植物次生代謝物積累有關。結合miRNA和降解組的測序結果，發現ama-miR156（Lus10003126）、bdi-miR397b-5p（Lus10017175）、lja-miR397（Lus10027782）、csi-miR160（Lus10021467）、aly-miR319c-p（Lus10008685）和gma-miR369h（Lus10011558）在雙亞4號和NEW莖稈不同發育時期中最顯著差異表達。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，除gma-miR369h與其靶基因Lus10011558隨亞麻莖稈的生長發育表達模式無明顯規律外，其余5個miRNA與其靶基因表達模式恰好相反?！窘Y論】亞麻莖稈木質素的積累過程與轉錄因子MYB、漆酶、生長素響應因子等編碼基因密切相關，且這些基因可被其相應的miRNA負調控，并參與亞麻莖稈中木質素的積累。

關鍵詞： 亞麻;木質素;積累;miRNA;靶基因;挖掘

中圖分類號： S563.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2321-10

Mining and analysis of miRNAs and target genes related to lignin accumulation in flax stalks at different developmental stages

XIE Dong-wei， SUN Jian*

（School of Life Science， Nantong University， Nantong， Jiangsu? 226019， China）

Abstract：【Objective】Mining and analysis of miRNA and regulatory combination of target genes related to lignin accumulation in different development stage of stalk in flax could provide important reference for the analysis of dynamic lignin accumulation in flax fiber layer. 【Method】The stems of Shuangya 4 （low lignin） and NEW （high lignin） after flowering 20，30 and 40 d were used as research materials. Dynamic changes of miRNA transcription level and target gene annotation function were analyzed based on miRNA sequencing and degradation group sequencing. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression patterns of miRNAs and their target genes with the most significant differences between the two flax varieties. 【Result】Stalk miRNA libraries were constructed at 20，30 and 40 d after flowering of Shuangya 4 and NEW. 305 unique miRNAs were identified in this study，including 143 known conserved miRNAs and 162 newly miRNAs. Moreover，different transcripts of these miRNAs target genes were not all regulated by miRNAs. Target genes were predicted from 305 identified miRNAs and flax genome sequence information. A total of 286 miRNAs with 4807 target genes were identified，and another 19 miRNAs did not predict target genes. A total of 97 target genes of 21 miRNAs were obtained through integrated analysis of the sequencing data of the degradation group，and a total of 97 degradation sites were detected，accounting for only 2% of the total number of miRNA target genes（4807） identified in the flax stalk. There were still a large number of target genes that have not been identified. In the degradation group，97 target genes were functionally annotated，among which 22 were related to plant growth and development，16 were transcription factors and 7 were related to plant secondary metabolite accumulation. Combined with the sequencing results of miRNA sequencing and degradation group sequencing，it was found that ama-miR156（Lus10003126），bdi-miR397b-5p（Lus10017175），lja-miR397（Lus10027782），csi-miR160（Lus10021467）， aly-miR319c-p（Lus10008685） and gma-miR369h （Lus10011558） were most significantly different in different development time of stalks between Shuangya 4 and NEW. The results of? real-time quantitative fluorescence PCR showed that the expression pattern of gam-miR369h and its target gene Lus10011558 with the growth and development of stalk was not obvious， but the expression patterns of the other five miRNAs with their target genes were just the opposite. 【Conclusion】The process of lignin accumulation in flax stalks is closely related to MYB transcription factor，laccase，auxin response factor and SPL genes. These target genes can be negatively regulated by their corresponding miRNAs and participate in the accumulation of lignin in flax stalks.

Key words： flax; lignin; accumulation; miRNA; target gene; mining

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31801409）; Heilongjiang Natural Science Foundation（C2018061）

0 引言

【研究意義】亞麻（Linum ustitatissimum L.）為亞麻科亞麻屬一年生草本植物，是人類最早使用的天然植物纖維，其纖維紡織品具有透氣、吸濕、抗菌及對人體無害等優點，日益受到人類的關注。但目前亞麻紡織業中優質亞麻纖維原料嚴重短缺，且其纖維品質和紡織性能易受木質素含量影響，究其原因是木質素會使纖維變硬、變脆（王玉富等，2008）?？梢?，木質素是制約紡織品質量的主要影響因子，且去除木質素工藝會產生大量廢水從而造成環境污染。近些年來，已有學者對miRNAs在不同植物發育時期組織中的表達模式進行分析，發現miRNAs在植物的生長發育過程中發揮重要調控功能作用（Parizotto et al.，2004;Megraw et al.，2006;劉潮等，2019）。因此，深入挖掘亞麻不同發育時期莖稈中的miRNA及其靶基因，對揭示亞麻纖維層木質素動態積累的調控作用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已有大量關于參與調控木質素合成的miRNA及其靶基因的研究報道。在擬南芥中，miR857通過作用于其靶基因AtLAC7來參與調控維管組織的次生生長，在miR857過表達植株中，AtLAC7基因表達量下調，漆酶活性下降10.8%，鮮重和莖直徑分別下降6.5%和18.4%，莖拉伸力下降26.4%，木質素含量降低;而miR857敲除株系表現出漆酶活性增加33.3%，鮮重和莖直徑分別增加14.7%和10.0%，莖拉伸力增加26.4%，植株木質素含量明顯增加，次生木質部木質化程度增強（Zhao et al.，2015）。miR397b通過作用于其靶基因AtLAC4而調控木質素含量，miR397b過表達株系表現出木質素含量降低，次生壁厚度變薄，愈創木基和紫丁香基單體數目減少，但生殖生長期的植株表現出花序數目增多，致使果莢數也增多，產量提高，過表達AtLAC4基因的植株則表現出與之相反的表型（Wang et al.，2014）。在陸地棉中，GhLAC4基因mRNA的切割發生在miR397b及該基因的互補區域，說明GhLAC4基因是miR397b的靶基因，也暗示GhmiR397b可能參與棉花纖維中木質素的形成（丁妍等，2017）。在歐洲大葉楊中共發現49個漆酶基因（PtrLACs），其中有29個為Ptr-miR397a的靶基因，將Ptr-miR397a轉入楊樹中，結果發現Ptr-miR397a的靶基因中有17個PtrLACs下調表達，且轉基因株系中木質素含量降低12%～22%，漆酶活性約下降40%，但木質素結構和組成未發生明顯變化，證明漆酶參與木質素合成作用，且Ptr-miR397a是木質素合成的主要調節因子（Lu et al.，2013）。在玉米中，ZmmiR528作用于其靶基因ZmLAC3和ZmLAC5，當ZmmiR528過表達時，ZmLAC3和ZmLAC5基因表達量下降，木質素含量和莖桿穿刺強度降低;當敲減ZmmiR528或ZmLAC3過表達時，植株表現出相反的表型（Sun et al.，2018）。上述研究結果均表明，miRNA能通過調控其靶基因進而影響植株木質素含量。此外，轉STTM164基因楊樹的木質部細胞層數和細胞壁厚度較野生型明顯增加，從而導致木質部加厚，木質素含量增加（梁瀾，2017）。目前，關于亞麻木質素積累分子方面的研究報道相對較少。王進等（2009）以亞麻栽培品種白花為材料，采用半定量RT-PCR對亞麻木質素合成關鍵酶基因CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、F5H2、F5H3在亞麻不同明顯的組織及不同時期木質部和韌皮部的表達規律進行研究，結果發現這些基因呈組織特異性表達。龍松華等（2014）將已克隆獲得的亞麻木質素合成關鍵酶咖啡酸-O-甲基轉移酶基因（COMT）全長cDNA序列通過農桿菌介導轉化亞麻，獲得轉基因植株，通過β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色和PCR檢測，證實干擾載體已成功轉入亞麻中，為推進亞麻纖維品質改良的分子育種打下基礎。袁紅梅等（2016）以亞麻莖總RNA為模版，通過RT-PCR擴增獲得木質素合成關鍵酶糖基轉移酶基因LuUGT72E1的全長開放閱讀框（ORF）序列，并推測該酶參與木質素單體的糖基化修飾過程?！颈狙芯壳腥朦c】至今，有關亞麻木質素積累分子調控方面的研究報道較少，且主要集中在上述少數幾個木質素合成酶基因的克隆及其表達方面。雖然獨立的miRNA數據分析可為解析不同發育時期亞麻莖稈中木質素積累提供重要信息，整合miRNA和降解組數據動態變化可為揭示miRNA調控基因表達提供較直接的證據，但目前針對參與亞麻莖稈木質素積累的miRNA及其靶基因挖掘分析的相關研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以雙亞4號（低木質素）和NEW（高木質素）花后20、30和40 d的莖稈為試驗材料，基于miRNA測序和降解組測序結果分析miRNA轉錄水平動態變化及其靶基因注釋功能，采用實時熒光定量PCR檢測2個亞麻品種間表達差異最顯著的miRNA及其靶基因的表達模式，為解析亞麻纖維層木質素動態積累提供重要參考，也為利用生物技術手段培育低木質素的優質亞麻新品種提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為高木質素亞麻品種NEW（原產法國）和低木質素亞麻品種雙亞4號（原產中國），由黑龍江省農業科學院經濟作物研究所提供。于2019年4月中旬播種于黑龍江省農業科學院哈爾濱試驗基地（東經126°68′，北緯45°65′），從播種到收獲的年均降水量為350.2 mm，年均氣溫4.26 ℃。每份材料按行種植，行長10 m，行間距20 cm，設3次重復，10行區，小區面積20 m2，播種方式為條播，田間管理同大田生產。開花期對同一開花時間的亞麻植株進行掛牌標記，以備取樣。主要試劑：Small RNA Sample Pre Kit、T4 RNA Ligase 1和T4 RNA Ligase 2購自天根生化科技（北京）有限公司;TRIzol（Invitrogen）購自北京雅安達生物技術有限公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）和SYBR Premix Ex Taq購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。主要儀器設備：Hiseq 2500（Illumina，美國）、2100 Bioanalyzer（Agilent，德國）和羅氏LightCycler 2.10 PCR儀（Roche，瑞士）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 miRNA文庫構建及測序分析 采集亞麻品種雙亞4號和NEW花后20、30和40 d的莖稈下部5 cm（子葉節以上5～10 cm區段）進行RNA提取，設3次生物學重復，共18個樣品。RNA檢測合格后，取其1.5 μg作為RNA樣本起始量，用ddH2O補充至6.0 μL，使用Small RNA Sample Pre Kit試劑盒進行mi-RNA文庫構建。由于miRNA的5'端有磷酸基團、3'端有羥基，利用T4 RNA Ligase 1和T4 RNA Ligase 2分別在其3'端和5'端連接上接頭，反轉錄合成cDNA，切膠回收得到的目的片段即為miRNA文庫。使用Qubit 2.0對miRNA濃度進行檢測，并稀釋至1 ng/μL，使用Agilent 2100 Bioanalyzer對Insert Size進行檢測，并以實時熒光定量PCR對miRNA的有效濃度進行準確定量，以保證miRNA文庫質量。采用Illumina HiSeq2500進行高通量測序，測序讀長為Single-end（SE）50 nt?；跍y序結果，鑒定分析miRNA及其靶基因的轉錄本信息

1. 2. 2 降解組cDNA文庫構建及測序分析 采集亞麻品種雙亞4號花后20、30和40 d的莖稈下部5 cm（子葉節以上5～10 cm區段）進行RNA提取，通過磁珠捕獲mRNA，5'-adaptor連接，以構建降解組cDNA文庫，并用Hiseq 2500進行降解組測序。原始Tags經過去接頭和過濾低質量，獲得Clean Tags和Cluster Tags（Clean Tags聚類數據）。將Cluster Tags與參考基因組進行比對，分析其在參考基因組上的分布情況。將Cluster Tags與Rfam數據庫進行比對，注釋非編碼RNA功能，未被注釋的序列將用于降解位點分析。利用Cleaveland進行降解位點檢測（Addo-Quaye et al.，2009），設置條件P-value<0.05。

1. 2. 3 實時熒光定量PCR驗證 選取長勢一致且健康的雙亞4號植株，采集花后0、10、20、30和40 d等5個時間點的莖桿下部5 cm（子葉節以上5～10 cm區段），設3次重復，液氮迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。用TRIzol提取上述樣品的總RNA，RNA經DNA酶消化處理后反轉錄合成第一鏈cDNA。根據miRNA測序和降解組測序結果篩選出6個在雙亞4號和NEW不同發育時期表達差異最顯著的miRNA，在降解組找到其被降解的靶基因，并根據靶基因的CDS序列，采用Primer 5.0設計引物，內參基因為GAPDH（表1）。實時熒光定量PCR在羅氏LightCycler 2.10 PCR儀上進行，熒光染料為SYBR Premix Ex Taq，設3次生物學重復。反應體系20.0 μL：2×Hi SYBR Green qPCR Mix 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性15 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 5 min，進行40個循環，4 ℃保存。以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量（Livak and Thomas，2001）。

1. 3 統計分析

試驗數據采用Excel 2010進行統計分析，并以GraphPad Prism 6.01制圖。

2 結果分析

2. 1 miRNA轉錄水平分析結果

試驗前期對亞麻不同發育時期莖稈中木質素進行含量測定及掃描電鏡觀察，結果發現亞麻花后20～40 d是木質素急劇積累的重要時期。因此，本研究選取亞麻品種雙亞4號和NEW花后20、30和40 d的莖稈構建miRNA文庫，并鑒定出305個miRNA，其中包括143個保守的miRNA和162個新鑒定的miRNA。本研究還對部分miRNA（包括保守的miRNA和新鑒定的miRNA）的靶基因不同轉錄本進行詳細分析，以期了解可變剪接是否造成轉錄本水平miRNA靶位點丟失，結果發現這些miRNA的靶基因不同轉錄本并非均受miRNA調控。如在保守的miRNA中，PB.11839可轉錄出5個轉錄本異構體，其中4個轉錄本可被miR160調控，另外丟失miR160靶位點的1個轉錄本是通過外顯子跳躍產生（圖1-A）;PB.19964可轉錄出7個轉錄本異構體，其中5個轉錄本可被miR168調控，其余2個轉錄本經外顯子跳躍事件而丟失miR168靶位點（圖1-B）;在新鑒定的miRNA中，PB.16138可轉錄出2個轉錄本，1個可被unconservative_scaffold204_9948調控，1個經可變接受位點事件后丟失靶位點（圖1-C）。為了更好的研究亞麻miRNA的功能，本研究將鑒定的miRNA與亞麻基因組序列信息進行靶基因預測，結果獲得286個miRNA的4807個靶基因，另外19個miRNA未預測到靶基因，可能是因為亞麻基因組提交數據并不完整，造成靶基因預測不全面。

2. 2 降解組測序分析結果

利用降解組測序技術鑒定miRNA靶基因是目前最常用和最高效的方法。以亞麻品種雙亞4不同發育時期（20、30和40 d）的莖稈構建3個降解組的cDNA文庫（D01、D02和D03），并結合上述高通量測序獲得的不同發育時期亞麻莖稈miRNA文庫信息進一步鑒定亞麻莖稈miRNA靶基因。利用Cleaveland進行降解位點檢測，結果發現，D01檢測到86個靶基因被降解，共有86個靶基因降解位點;D02檢測到92個靶基因被降解，共有92個靶基因降解位點;D03檢測到83個靶基因被降解，共有83個靶基因降解位點。通過對3個降解組測序數據進行整合分析，共獲得21個miRNA的97個靶基因，共檢測到97個降解位點，僅占鑒定出亞麻莖稈中miRNA靶基因總數（4807個）的2%，仍有大量的靶基因未被鑒定。為了探索靶基因的功能，本研究將被降解的97個靶基因與同源物種比對進行功能注釋，其中有22個靶基因與植物生長發育有關，如生長素響應因子（Auxin response factor）、生長調節因子（Growth regulate factor）和乙烯響應因子（Ethylene response factor）等;有16個靶基因為轉錄因子，如MYB、bHLH77和TCP2等;有7個靶基因與植物次生代謝積累有關，如銅氧化酶（Poly copper oxidase）、P450次生代謝酶（P450 secondary metabolism）和銅鋅超氧化物歧化酶（Copper zinc superoxide dismutase）等（表2）。

2. 3 實時熒光定量PCR驗證結果

結合miRNA測序和降解組測序結果篩選出6個在雙亞4號和NEW不同發育時期表達差異最顯著的miRNA，并根據降解組找到其被降解的靶基因：ama-miR156（Lus10003126）、bdi-miR397b-5p（Lus 10017175）、gma-miR396h（Lus1011558）、lja-miR397（Lus10027782）、csi-miR160（Lus10021467）和aly-miR319c-p（Lus10008685），共有6對miRNA-靶基因調控組合，最后采用實時熒光定量PCR檢測其在亞麻莖稈不同發育時期的表達模式，結果如圖2所示。6個miRNA及其對應靶基因均隨莖稈發育呈相反的表達模式。ama-miR156的相對表達量隨亞麻莖稈發育呈逐漸下降趨勢，而其靶基因Lus10003126的相對表達量呈逐漸升高趨勢，花后40 d相對表達量達最高，該靶基因被注釋為啟動子結合蛋白SBP，參與亞麻生長發育。bdi-miR397b-5p和lja-miR397的相對表達量均隨亞麻莖稈發育呈逐漸升高趨勢，均在花后40 d達最高，其靶基因Lus10017175和Lus10027782的表達模式恰好相反，整體上呈逐漸降低趨勢，在花后40 d相對表達量達最低值，且這2個靶基因均被注釋為漆酶基因，參與亞麻中次生代謝產物木質素的形成。aly-miR319c-p的相對表達量隨亞麻莖稈發育呈逐漸下降趨勢，其靶基因Lus10008685的表達模式恰好相反，在花后0～20 d的相對表達量緩慢升高，從花后30 d開始相對表達量迅速升高，該靶基因被注釋為轉錄因子MYB，據報道該家族轉錄因子調控植物木質素生物合成過程（李維靜等，2013），因此推斷該靶基因對亞麻木質素積累及結構形成發揮重要作用。csi-miR160的相對表達量隨亞麻莖稈發育呈逐漸下降趨勢，在花后40 d時降至最低值，其靶基因Lus10021467的相對表達量在花后0～10 d無明顯變化，從花后20 d開始相對表達量急劇增加，花后40 d達最高值，該靶基因被注釋為生長素響應因子，說明該基因與亞麻的生長發育及木質素積累關系密切。gma-miR369h及其靶基因Lus10011558隨亞麻莖稈的生長發育其表達模式無明顯規律，gma-miR369h的相對表達量在花后0～30 d無明顯變化，花后40 d明顯下降，其靶基因Lus10011558的相對表達量在花后10～40 d均無明顯變化。故推測這些miRNA及其靶基因在亞麻莖稈不同發育期相互作用，共同參與亞麻莖稈發育與次生代謝產物積累。

3 討論

在紡織業、造紙業等工業生產中，木質素是造成纖維加工廢棄物污染，影響纖維品質的主要因素。木質素是影響植物材料加工利用的主要限制因子。纖維中木質素含量過高會導致纖維偏硬脆，可紡性和服用性能差。由于木質素的去除難度大，木質素含量高則易導致脫膠成本高和工業污染（Vanholme et al.，2012）。因此，亞麻中木質素含量直接影響亞麻纖維的品質，直接決定其經濟效益（Meagher and Beecher，2000）。Huis等（2012）將代謝組學和轉錄組學相結合對亞麻莖稈的木質部和莖外韌皮纖維部分的木質化進行研究，結果發現代謝中間體松柏醇最終可以產生木質素，但該研究未提及亞麻莖稈木質素積累過程中相關基因的表達情況。至今，未見有關調控亞麻莖稈木質素積累的相關miRNA及其靶基因的研究報道。本研究對亞麻莖稈不同發育時期的miRNA轉錄水平進行深入分析，結果發現亞麻莖稈木質素的積累過程與轉錄因子MYB、漆酶及生長素響應因子等編碼基因密切相關。該結論推進了亞麻莖稈木質素積累方面的研究進展，并為利用生物技術手段培育低木質素優質纖維亞麻新品種提供了重要參考。

miR156是一類調控細胞生長的miRNA，其靶基因SPL10和SPL11能控制細胞分裂（Nodine and Bartel，2010），在胚發育早期（花后10 d）miR156可抑制SPL10和SPL11基因的表達，阻礙植株生長發育（Pa-latnik et al.，2003;Wang et al.，2012）。本研究也發現，ama-miR156在亞麻莖稈發育過程中的相對表達量呈逐漸下降趨勢，且其靶基因Lus10003126在花后20～40 d的相對表達量明顯升高，說明ama-miR156在亞麻莖稈發育中后期對其靶基因的抑制作用越來越弱，從而促進莖稈纖維層的正常發育。此外，楊樹中Ptr-miR397a過表達會引起17個漆酶基因的相對表達量下調，導致木質素含量降低（Lu et al.，2013）;擬南芥AtmiRNA397b過量表達會致使AtLAC4基因的相對表達量降低，導致木質素含量降低（Wang et al.，2014）。本研究中，bdi-miR397b-5p和lja-miR397的相對表達量隨亞麻莖稈發育呈逐漸升高趨勢，均在花后40 d達最高值，其靶基因Lus10017175和Lus10027782表達模式恰好相反，整體上呈逐漸降低趨勢，由于這2個靶基因均被注釋為漆酶，故推測這2個miRNA負調控亞麻木質素合成，且在不同物種中的功能具有一定的保守性。

本研究中，aly-miR319c-p的相對表達量隨亞麻莖稈發育呈不斷下降趨勢，其靶基因Lus10008685被注釋為轉錄因子MYB，相對表達量不斷升高。Shen等（2012，2013）研究發現，柳枝稷中過表達R2-R3-MYB轉錄因子基因家族成員PvMYB4，在未經酸預處理的條件下即可使糖化效率增加300%，導使纖維素乙醇產量比普通植株提高2.6倍。由于miR319c-p及其靶基因在植物木質素發育過程中的作用未見相關研究報道，因此aly-miR319c-p及其靶基因Lus10008685調控木質素合成的功能是本研究新發現，但其具體作用機理還需進一步研究驗證。miR160是植物中一類較重要的miRNA家族，具有組織特異性表達的特點，能在模式植物擬南芥中反饋調節生長素響應因子的表達，從而影響植株對生長素的敏感性，進而調控植物的生長發育（Mallory et al.，2005）。吳書昌（2016）利用深度測序技術發現miR160在棉花胚珠的發育及纖維起始過程中特異表達，推測其可能會影響棉花胚珠的發育和纖維的起始。本研究也發現，隨著亞麻莖稈的發育csi-miR160相對表達量不斷下降，其靶基因Lus10021467的相對表達量不斷上升，該靶基因被注釋為生長素響應因子，推測csi-miR160及其靶基因Lus10021467在亞麻莖稈纖維發育和木質素積累方面扮演重要調控角色，進一步驗證前人的相關研究結果。

雖然在紡織業、造紙業等工業生產中，木質素是造成纖維加工廢棄物污染及影響纖維品質的主要因素，但木質素在植物組織中具有增強細胞壁及黏合纖維的作用，對植物的生長起機械支持抗壓的作用。因此，在今后培育低木質素亞麻品種時要充分利用miRNA及靶基因在亞麻韌皮部（纖維層）特異表達這一特性進行有目標地降低亞麻韌皮部（纖維層）的木質素含量，而不影響其植株的抗倒伏性，從而培育抗倒伏性強、纖維品質好的亞麻新品種。

4 結論

亞麻莖稈木質素的積累過程與轉錄因子MYB、漆酶、生長素響應因子等編碼基因密切相關，且這些靶基因可被其相應的miRNA負調控，并參與亞麻莖稈中木質素的積累。

參考文獻：

丁妍，王燕美，劉進元. 2017. 陸地棉miR397b的生化功能驗證[J]. 上海農業學報，33（1）：10-14. [Ding Y，Wang Y M，Liu J Y. 2017. Identification of the biochemical function of miR397b in Gossypium hirsutum[J]. Acta Agriculturae Shanghai，33（1）：10-14.]

李維靜，蘇衍菁，蘇相亭，卜仕金. 2013. MYB轉錄因子在植物木質素合成中的調控機理[J]. 山東畜牧獸醫，34（11）：69-71. [Li W J，Su Y J，Su X T，Bu S J. 2013. Regulation mechanism of MYB transcription factor in plant lignin synthesis[J]. Shandong Journal of Animal Husbandry and Veterinary Science，34（11）：69-71.]

梁瀾. 2017. PtrmiR164a在楊樹次生細胞壁合成過程中的功能研究[D]. 重慶：西南大學. [Liang L. 2017. Functional characterization of PtrmiR164a invoved in the regulation of secondary cell wall in Populus[D]. Chongqing：Southwest University.]

劉潮，褚洪龍，韓利紅，楊云錦，高永，唐利洲. 2019. 桑樹NBS-LRR類基因家族的全基因組鑒定及其調控micro-RNAs分析[J]. 江蘇農業學報，35（3）：544-553. [Liu C，Chu H L，Han L H，Yang Y J，Gao Y，Tang L Z. 2019. Genome-wide identification of NBS-LRR genes and regulation analysis by microRNAs in mulberry[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，35（3）：544-553.]

龍松華，喬瑞清，李翔，陳信波，鄧欣，邱財生，郭媛，郝冬梅，王玉富. 2014. 亞麻木質素合成相關基因COMTRNAi表達載體構建及轉化[J]. 中國麻業科學，36（4）：169-173. [Long S H，Qiao R Q，Li X，Chen X B，Deng X，Qiu C S，Guo Y，Hao D M，Wang Y F. 2014. Construction of RNAi vector caffeic acid O-methyltransferase gene and transformation in flax[J]. Plant Fiber Sciences in China，36（4）：169-173.]

王進，陳信波，高原，張彥紅，龍松華，鄧欣，何東鋒，王玉富. 2009. 亞麻木質素合成關鍵酶基因表達分析[J]. 作物學報，35（8）：1468-1473. [Wang J，Chen X B，Gao Y，Zhang Y H，Long S H，Deng X，He D F，Wang Y F. 2009. Expression of critical lignin metabolism genes in flax（Linum usitatissimum）[J]. Acta Agronomica Sinica，35（8）：1468-1473.]

王玉富，黃海燕，薛召東，邱財生，郝冬梅. 2008. 亞麻CAD基因克隆及反義表達載體的構建[J]. 中國麻業科學，30（6）：289-292. [Wang Y F，Huang H Y，Xue Z D，Qiu C S，Hao D M. 2008. Cloning of partial sequences of cinnamyl alcohol dehydrogenase gene from flax and construction of its antisense expression vector[J]. Plant Fiber Sciences in China，30（6）：289-292.]

吳書昌. 2016. MiR160在棉花胚珠發育中功能分析[D]. 武漢：華中農業大學. [Wu S C. 2016. Functional characteri-zation of miR160 in cotton ovule development[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.]

袁紅梅，郭文棟，趙麗娟，于瑩，吳建忠，程莉莉，趙東升，康慶華，黃文功，姚玉波，宋喜霞，姜衛東，劉巖，馬廷芬，吳廣文，關鳳芝. 2016. 亞麻糖基轉移酶基因LuUGT72E1的克隆與表達分析[J]. 作物雜志，（4）：62-67. [Yuan H M，Guo W D，Zhao L J，Yu Y，Wu J Z，Cheng L L，Zhao D S，Kang Q H，Huang W G，Yao Y B，Song X X，Jiang W D，Liu Y，Ma T F，Wu G W，Guan F Z. 2016. Cloning and expression analysis of the glycosyltransferase gene LuUGT72E1 in flax[J]. Crops，（4）：62-67.]

Addo-Quaye C，Miller W，Axtell M J. 2009. CleaveLand：A pipeline for using degradome data to find cleaved small RNA targets[J]. Bioinformatics，25（1）：130-131.

Huis R，Morreel K，Fliniaux O，Lucau-Danila A，Fenart S，Grec S，Neutelings G，Chabbert B，Mesnard F，Boerjan W，Hawkins S. 2012. Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems[J]. Plant Physiology，158（4）：1893-1915.

Livak K J，Thomas D S. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，25（4）：402-408.

Lu S，Li Q，Wei H，Chang M J，Tunlaya-Anukit S，Kim H，Liub J，Song J Y，Sun Y H，Yuan L，Yeh T F，Peszlen I，Ralph J，Sederoff R R，Chiang V L. 2013. Ptr-miR397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，110（26）：10848-10853.

Mallory A C，Bartel D P，Bartel B. 2005. microRNA-directed regulation of Arabidopsis AUXIN RESPONSE FACTOR17 is essential for proper development and modulates expression of early auxin response genes[J]. The Plant Cell，17（5）：1360-1375.

Meagher L P，Beecher G R. 2000. Assessment of data on the lignan content of foods[J]. Journal of Food Composition and Analysis，13（6）：935-947.

Megraw M，Baev V，Rusinov V，Jensen S T，Kalantidis K，Hatzigeorgiou A G. 2006. microRNA promoter element discovery in Arabidopsis[J]. RNA，12（9）：1612-1619.

Nodine M D，Bartel D P. 2010. microRNAs prevent precocious gene expression and enable pattern formation du-ring plant embryogenesis[J]. Genes Development，24（23）：2678-2692.

Palatnik J F，Allen E，Wu X，Schommer C，Schwab R，Carrington J C，Weigel D. 2003. Control of leaf morphogenesis by microRNAs[J]. Nature，425（6955）：257-263.

Parizotto E A，Dunoyer P，Rahm N，Himber C，Voinnet O. 2004. In vivo investigation of the transcription，proces-sing，endonucleolytic activity，and functional relevance of the spatial distribution of a plant miRNA[J]. Genes Development，18：2237-2242.

Shen H，He X，Poovaiah C R，Wuddineh W A，Ma J，Mann D G J，Wang H，Jackson L，Tang Y，Chen F，Dixon R A. 2012. Functional characterization of the switchgrass（Pani-cum virgatum） R2R3-MYB transcription factor PvMYB4 for improvement of lignocellulosic feedstocks[J]. New Phytologist，193（1）：121-136.

Shen H，Poovaiah C R，Ziebell A，Tschaplinski T J，Pattathil S，Gjersing E，Engle N L，Katahira R，Pu Y，Sykes R. 2013. Enhanced characteristics of genetically modified switchgrass（Panicum virgatum L.） for high biofuel production[J]. Biotechnology for Biofuels，6（1）：71-86.

Sun Q，Liu X G，Yang J，Liu W W，Du Q G，Wang H Q，Fu C X，Li W X. 2018. microRNA528 affects lodging resistance of maize by regulating lignin biosynthesis under nitrogen-luxury conditions[J]. Molecular Plant，11（6）：806-814.

Vanholme R，Storme V，Vanholme B，Sundin L，Christensen J H，Goeminne G，Halpin C，Rohde A，Morreel K，Boerjan W. 2012. A systems biology view of responses to lignin biosynthesis perturbations in Arabidopsis[J]. The Plant Cell，24（9）：3506-3529.

Wang C Y，Zhang S，Yu Y，Luo Y C，Liu Q，Ju C，Chen Y Q. 2014. miR397b regulates both lignin content and seed number in Arabidopsis via modulating a laccase involved in lignin biosynthesis[J]. Plant Biotechnology Journal，12（8）：1132-1142.

Wang S K，Wu K，Yuan Q B，Liu X Y，Liu B，Lin X Y，Zeng R Z，Zhu H T，Dong G J，Qian Q，Zhang G Q，Fu X D. 2012. Control of grain size，shape and quality by OsSPL16 in rice[J]. Nature Genetics，44（8）：950-954.

Zhao Y Y，Lin S，Qiu Z B，Cao D C，Wen J L，Deng X，Wang X H，Lin J X，Li X J. 2015. microRNA857 is involved in the regulation of secondary growth of vascular tissues in Arabidopsis [J]. Plant Physiology，169（4）：2539-2552.

（責任編輯 陳 燕）