貴州漢族人群23個STR基因座的OL等位基因研究

張 昊，胡錫階，劉祖林，羅 麗，萬衛紅，陳鵬宇，余麗梅

(1.遵義醫科大學附屬醫院 貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫科大學 法醫學院，貴州 遵義 563099；3.遵義醫科大學附屬醫院 司法鑒定中心，貴州 遵義 563099)

短串聯重復序列(Short tandem repeat,STR)是一類長度多態性遺傳標記，在人類基因組中分布廣泛，核心重復單位數目的變化形成了STR基因座的遺傳多態性[1]。STR基因座在不同人群中存在顯著的群體遺傳結構差異，主要表現在等位基因的數目、分布頻率、突變和序列結構特征等方面[2-3]。在法醫學實踐中，對特定群體的STR基因座進行遺傳多態性調查，是應用于該群體個體識別、親權鑒定以及群體遺傳學研究的基本前提。

OL(Off-Ladder)等位基因是采用國際標準化檢測儀器對STR進行等位基因分型時，因所檢測的等位基因未被包含在商品化試劑盒等位基因分型標準物(Allelic ladder)中，不能被儀器自動識別和程序化數字命名的等位基因[4]。其來源于群體中發生微變異的等位基因或稀有等位基因，多數情況下是具有群體特征性而之前未報道的新等位基因。目前，國內外多個實驗室相繼在不同群體或單個STR基因座上檢測出OL等位基因[5-7]，貴州漢族群體的OL等位基因數據尚缺乏。本研究應用在中國群體中遺傳多態性高的Huaxia PlatinumTM試劑盒，對貴州漢族人群23個常染色體STR基因座的OL等位基因進行統計和分析，以期補充和完善貴州漢族群體的遺傳多態性數據。并與采用相同檢測體系的群體進行OL等位基因及頻率比較，進一步探討OL等位基因在不同群體中的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料 樣本來源于遵義醫科大學附屬醫院法醫鑒定中心法醫物證室(即貴州省細胞工程重點實驗室分子生物學技術室的法醫物證室)親子鑒定的日常檢案，隨機選取2016～2018年1 291例貴州漢族無關個體血樣，其中男性882例，女性409例。

1.2 主要試劑與儀器 Huaxia PlatinumTM試劑盒、等位基因分型標準物、內標(LIZ600)、POP 4凝膠和緩沖液(ABC、CBC)均為美國ABI公司產品，Veriti 96 well PCR擴增儀和3500-DX遺傳分析儀也購于美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 制備FTA血卡 取80 μL血液均勻涂至FTA卡中央區域，室溫自然干燥，手動打孔器取下直徑約1 mm血斑放入PCR管。

1.3.2 PCR擴增與毛細管電泳 嚴格按照Huaxia PlatinumTM試劑盒說明，配置擴增體系和設置循環參數。PCR擴增體系共10 μL，其中Master Mix 4.0 μL、Primer Set 4.0 μL、Pure water 2.0 μL。反應循環參數為：95 ℃ 1 min；94 ℃ 3 s，59 ℃ 16 s，65 ℃ 29 s，26個循環；60 ℃ 5 min；4 ℃ 保存。取1 μL PCR擴增產物，與9.6 μL甲酰胺和0.4 μL內標混合，使用3500-DX遺傳分析儀進行毛細管電泳。每批樣本均同時檢測等位基因分型標準物(ladder)、陽性對照(control 007)和陰性對照(water)。

1.3.3 基因分型與OL等位基因命名 應用Gene Mapper ID-X 1.4 software(美國ABI公司)分析電泳結果，以試劑盒ladder為參照標準，獲得等位基因分型。對于在分型圖譜中未被數字化命名的OL等位基因，根據《司法鑒定技術規范》(SF/Z JD0105011-2018)，參照內標計算每個帶有實際分子量標的信號峰的位置來進行命名。

1.3.4 參考群體選擇與群體比較 參考群體納入標準：(1)采用與本研究相同的檢測體系；(2)報道數據通過質控；(3)具有語系、地域、民族代表性。

檢索PubMed、CNKI和萬方數據庫，選取四川漢族(n=309)[8]、海南漢族(n=193)[9]、四川藏族(n=198)[9]、華東漢族(n=500)[10]、內蒙古蒙古族(n=100)[10]、寧夏回族(n=183)[11]和新疆哈薩克族(n=550)[12]作為參考群體，獲得各群體的等位基因頻率后，篩選出OL等位基因及分布頻率作為比較數據。

2 結果

2.1 等位基因分型標準物 Huaxia PlatinumTM試劑盒包含23個常染色體STR基因座(D3S1358、vWA、D16S539、CSF1PO、TPOX、D8S1179、D21S11、D18S51、Penta E、D2S441、D19S433、TH01、FGA、 D22S1045、D5S818、D13S317、D7S820、D6S1043、D10S1248、D1S1656、D12S391、D2S1338、Penta D)及2個性別鑒定基因座Amelogenin和Y-indel (rs2032678)，各基因座可見數目不等的標準物等位基因分型圖譜(見圖1)。

2.2 貴州漢族群體OL等位基因分型及其頻率 1 291例無關個體共檢出36個OL等位基因，分布于vWA、D16S539、D21S11、D18S51、Penta E、D2S441、D19S433、FGA、D22S1045、D7S820、D6S1043、D1S1656、D12S391和D2S1338 共14個STR基因座，各基因座可見1～8個OL等位基因，基因頻率為0.0004～0.0232(見表1)。36個OL等位基因分為兩種類型：5個超出ladder范圍而位于兩個鄰近基因座ladder之間(見圖2A)，分別為vWA(10)、D6S1043(6,8)、D12S391(28)和D2S1338(29)；其余31個出現在基因座ladder最大和最小等位基因范圍內(見圖2B)。

1 291例樣本中，235例共檢出OL等位基因256次。其中214例為單個基因座上出現1個OL等位基因；3例為單個基因座上的2個等位基因均為相同的OL等位基因，即由OL等位基因組成的純合子(見圖2C)；18例為兩個不同的基因座上各出現1個OL等位基因(見圖2D)。

圖1 Huaxia PlatinumTM試劑盒ladder分型圖譜

表1 貴州漢族群體OL等位基因及其頻率

續表

A: D6S1043 OL 6; B: D2S441 OL 9.1; C: D2S441 OL 9.1; D: D7S820 OL 12.1; D2S441 OL 12.3。圖2 OL等位基因分型分型圖譜

2.3 貴州漢族與參考群體OL等位基因及頻率比較 與四川漢族、海南漢族、華東漢族、四川藏族、寧夏回族、內蒙古蒙古族和新疆哈薩克族7個群體相比，貴州漢族人群發現OL等位基因數目最多，分布基因座最廣。D2S441(10.1)、D16S539(6)、D18S51(8)、vWA(10)、D7S820(12.1)、D19S433(9.2,18)、FGA(27.2)、D22S1045(12.1)和 D6S1043(6,19.2,19.3)共12個等位基因僅在貴州漢族中檢出，其中10個為稀有等位基因；D1S1656(18)和FGA(23.2)在所有群體中均有檢出，且等位基因頻率在各群體均高于1‰。

圖3 貴州漢族與參考群體OL等位基因頻率比較

3 討論

OL等位基因產生的主要原因是等位基因突變引起的核酸缺失、插入或核苷酸改變，這種改變也被稱為微變異[4]，同時之前未報道過的新等位基因也會被檢測為OL。OL等位基因主要分為兩種類型：一類是超出ladder范圍而位于兩個鄰近基因座ladder之間，通常是由STR基因座滑動突變形成的稀有等位基因，表現為核心序列的完整重復；另一類是出現在基因座ladder最大和最小等位基因范圍內，通常由于微變異引起，表現為核心序列的不完整重復。本研究中，前一類5個OL等位基因vWA(10)、D6S1043(6,8)、D12S391(28)和D2S1338(29)均為核心序列完整重復的稀有等位基因(頻率低于1‰)；后一類31個OL等位基因中僅6個為核心序列的完整重復，其余25個為核心序列的不完整重復。綜合OL等位基因類型和分布頻率，在貴州漢族人群中檢出的OL等位基因多出現在基因座ladder最大和最小等位基因范圍內(31/36)，多表現為核心序列的不完整重復(25/36)，以稀有等位基因居多(19/36)。

Huaxia PlatinumTM試劑盒作為在中國人群遺傳多態性數據基礎上研發的復合擴增體系，在多個群體遺傳學調查中展現出高度的多態性和鑒別能力[13-14]。23個常染色體STR基因座包括了美國聯合DNA檢索系統、歐洲標準基因座和中國國家數據庫推薦使用的所有核心基因座，在保證高系統效能的同時，能有效實現與已知數據庫的數據共享和比對。應用該體系檢測貴州漢族群體，OL等位基因在14個STR基因座上被檢出，而9個STR基因座上未檢出。D6S1043和FGA基因座所含OL等位基因較多，分別為8個和7個，其余基因座均不超過3個。結合各基因座的法醫學參數，發現檢出OL等位基因的14個基因座均為貴州漢族群體的高鑒別能力基因座(DP>0.9,Ho>0.7)，而在低鑒別能力或中等鑒別能力的基因座上未檢出，如TH01和TPOX基因座。這表明OL等位基因使得所在基因座的鑒別能力增強，包含的多態性信息更為豐富。

本研究在貴州漢族群體中檢出OL等位基因比例較高，占總樣本18.20%(235/1 291例)；且個別OL等位基因的頻率較高，如D2S441基因座的9.1等位基因頻率達到0.0232，D1S1656基因座的18等位基因頻率也達到0.0128。與前述3個漢族群體和4個少數民族群體比較，從OL等位基因數目來看，8個群體的OL等位基因多分布于D2S441、FGA和 D6S1043三個基因座，不同群體OL等位基因分布的基因座及數目具有一定差異。8個群體總體呈現出樣本量越大檢出OL等位基因數目越多，而各群體的OL等位基因總頻率保持在較為恒定的范圍(0.11±0.0345)，即顯示為各群體的遺傳基因趨于穩定。對于相近樣本量的群體，漢族群體檢出OL等位基因數目多于少數民族群體，這可能是因為漢族在人口遷移或社會變動中更多地與不同民族、地域的人群發生基因交流和融合，形成漢族的遺傳多態性信息更為復雜所致，而少數民族由于地理環境相對封閉，外族通婚相對較少，遺傳多態性更為保守。按語系分類，漢族和回族屬于漢藏語系的漢語語族，藏族屬于漢藏語系的藏緬語族，蒙古族和哈薩克族分別屬于阿爾泰語系的蒙古語族和突厥語族。在6個漢藏語系和2個阿爾泰語系群體中，觀察到部分OL等位基因僅檢出于漢藏語系的群體，在阿爾泰語系的群體未檢出，說明OL等位基因在漢藏語系和阿爾泰語系群體中存在一定差異。因目前Huaxia PlatinumTM檢測體系的群體遺傳多態性數據較為缺乏，有待增加南島語系、南亞語系和印歐語系的群體以進一步探討OL等位基因在不同語系群體中的差異性。從OL等位基因頻率來看，在多個群體中觀察到等位基因頻率較高的OL等位基因，如D1S1656基因座的18等位基因，在8個群體中均被檢出，且等位基因頻率不低于0.005。這提示試劑盒生產公司應特別注意收集各群體的OL等位基因數據，有必要將多數群體中頻率高的OL等位基因納入ladder，不斷優化和完善試劑盒。同時，也觀察到一些OL等位基因僅存在特定群體或少數群體(如D2S441基因座的10.1等位基因僅存在于貴州漢族人群)，等位基因頻率較低，是與其他群體在遺傳結構上具有差異性的反映。這類具有明顯群體特征的OL等位基因有利于個體排查、甄別，甚至確認，在災難遺骸識別或混合物鑒定等案件調查中具有強大的應用價值。

實際檢案檢測到OL等位基因時，其頻率按照該基因座上等位基因頻率的最小值取值。對于超過稀有等位基因評定標準的OL等位基因，計算時若仍取最小等位基因頻率，必然會增大該基因座的父權指數，從而影響累計父權指數的計算結果。OL等位基因對DNA檢測結果判定有著重要影響，一方面，OL等位基因有助于提升基因座的鑒別能力，親子間相同的OL等位基因能夠增加親緣關系的確定；另一方面，OL等位基因的誤讀可能會影響案件分析的可靠性，增大鑒定風險，使法醫DNA檢測不能真正起到認定罪犯、保護無辜的作用。因此在鑒定工作中應警惕被標識為OL的等位基因。常染色體STR分型是目前法醫物證案件鑒定的金標準，基于STR長度多態性檢測結果，相同或相似長度的等位基因包含了更加豐富的多態性信息[15]。這意味著通過比照和推導相鄰等位基因長度命名的OL等位基因也極有可能包含了不同的序列結構組成。國際法醫學組織建立了專門的STR Base數據庫，接收并持續更新來自全球各實驗室的OL等位基因數據，隨著DNA數據庫的完善和新一代測序技術的發展，更加豐富的OL等位基因信息必將得到精準的解讀。

綜上可見，對貴州漢族人群23個STR基因座的OL等位基因進行比較分析，豐富了法醫學個體識別、親權鑒定、人類學和群體遺傳學研究中該群體的遺傳多態性數據。由于不同群體的OL等位基因存在基因座分布、等位基因數目及頻率的一定差異，OL等位基因的分析將在提高案件準確性中發揮重要作用。